Entwicklung und Optimierung eines Cytometric Bead Arrays zum Nachweis von afrikanischen hämorrhagischen Fieberviren

Abstract

Bei Viralen Hämorrhagischen Fiebern (VHF) handelt es sich um akute Infektionen mit hoher Infektiösität und hoher Letalität. Meist ist keine effektive Impfung oder kausale Therapie vorhanden oder sie ist nur begrenzt verfügbar. Aus diesem Grund besitzen viele der hämorrhagischen Fieberviren (HFV) auch ein hohes Risiko als biologische Kampfstoffe verwendet zu werden. Bei einem Ausbruch eines HFV kann es zur schnellen Verbreitung der Infektion kommen, sodass in kurzer Zeit eine große Anzahl an Proben auf mehrere HFV simultan getestet werden muss. Die etablierten Diagnostikmethoden von HFV basieren auf der Kombination von Virusisolation, molekularen (z.B. Real-Time‐PCR) und serologischen Nachweisverfahren (z.B. ELISA). Dennoch gibt es bisher kein diagnostisches Mittel um allen Anforderungen der HFV-Diagnostik gleichzeitig gerecht zu werden. In dieser Dissertation wurde deshalb ein Cytometric Bead Array (CBA) zum Nachweis der acht wichtigsten afrikanischen HFV (Lassa-Virus, Krim-Kongo-Virus, Rift-Valley-Fieber-Virus, Ebola-Zaire-Virus, Ebola-Sudan-Virus, Marburg-Virus, Dengue-Virus und Gelbfieber-Virus) entwickelt. Hierzu wurden aminierte virusspezifische Oligonukleotidsonden generiert und kovalent an carboxylierte, fluoreszenz-codierte Beads gekoppelt. Die verschiedenen afrikanischen HFV wurden simultan eine asymmetrische Reverse-Transkriptase-Multiplex‐PCR amplifiziert, für die zur späteren Detektion im Durchflusszytometer biotinylierte Reverse-Primer verwendet wurden. Anschließend konnten die biotinylierten Produkte der Multiplex‐RT‐PCR an die Bead-gekoppelten Oligonukleotidsonden hybridisiert werden. Die Analyse der erfolgreichen Hybridisierung am Durchflusszytometer basierte auf dem Nachweis eines durch Streptavidin konjugierten Fluoreszenzfarbstoffes, Phycoerythrin. In dem HFV-CBA aus dieser Arbeit war es sowohl im Uniplex-Hybridisierungsverfahren als auch im Multiplex-Hybridisierungsverfahren möglich alle acht HFV zu detektieren und spezifisch zu unterscheiden. Kreuzreaktivitäten wurden nicht beobachtet. Die analytische Sensitivität von 10^4-10^5 Moleküle/ml lag unter der durchschnittlichen Viruslast bei einer VHF-Infektion am Tag 6. der Infektion und war damit vergleichbar mit der Sensitivität quantitativer Real-time-PCR- Verfahren. Somit ist der in dieser Arbeit entwickelte CBA ein ideales Verfahren zur HFV-Diagnostik, das zeitsparend ist, eine hohe Spezifität und Sensitivität sowie eine gute Reproduzierbarkeit aufweist und einen hohen Probendurchlauf mit simultaner Detektion eines ganzen Spektrums verschiedener HFV ermöglicht.