dc.contributor.advisor | Schmidt, Christoph F. Prof. Dr. | de |
dc.contributor.author | Thiede, Christina | de |
dc.date.accessioned | 2012-10-24T15:59:37Z | de |
dc.date.accessioned | 2013-01-18T13:28:55Z | de |
dc.date.available | 2013-01-30T23:51:07Z | de |
dc.date.issued | 2012-10-24 | de |
dc.identifier.uri | http://hdl.handle.net/11858/00-1735-0000-000D-F08F-D | de |
dc.identifier.uri | http://dx.doi.org/10.53846/goediss-2595 | |
dc.description.abstract | Die vorliegende kumulative Doktorarbeit
beinhaltet in fünf Kapiteln (Kapitel 2, 3, 4, und 5 bestehend aus
publizierten Veröffentlichungen und Kapitel 6 bestehend aus einem
eingereichten Manuskript) neue Erkenntnisse über unterschiedlicher
Aspekte der Regulation von mitotischen kinesin-5 Motorproteinen.
Außerhalb des Themas der kinesin-5-Regulation besteht Kapitel 7 aus
einer publizierten Veröffentlichung über zellulare Motilität
neuronaler Rezeptoren, zu der ich in vivo Messungen in Neuronen
mittels TIRF-Mikroskopie beigetragen habe. In Kapitel 2 wurden
Faktoren untersucht, die Richtungsänderungen in Cin8 - eines der
zwei kinesin-5 Motorproteine in Saccharomyces cerevisiae -
verursachen. Bisher wurde angenommen, dass Motorproteinen eine
bestimmte, feste Bewegungsrichtung durch ihre Molekularstruktur
vorgegeben ist. Die gerichtete Bewegung von kinesin-5 erfolgt nach
bisherigem Kenntnisstand stets und unidirektional in Richtung des
Plus-Endes des Mikrotubulus (MT). Die hier präsentierten Ergebnisse
und die von dieser Arbeit unabhängigen, zeitgleich veröffentlichen
Daten einer aktuellen Studie von Roostalu et al. zeigten jetzt
allerdings, dass Cin8 wider Erwarten in der Lage ist seine
Bewegungsrichtung zu ändern. In der vorliegenden Studie wurde die
Direktionalität von Cin8 in vitro mittels Einzelmolekül-Fluoreszenz
in Motilitätsexperimenten und in vivo mittels live-cell-Mikroskopie
untersucht. Die in-vitro-Experimente zeigten, dass die
Bewegungsrichtung einzelner Cin8 Motorproteine entlang eines MT
durch Verringerung der Ionenstärke im Puffer von schneller,
prozessiver zum Minus-Ende gerichteter Bewegung zu langsamer zum
Plus-Ende gerichteter Bewegung „umgeschaltet“ werden konnte.
Hinweise auf einen physiologisch relevanteren
Regulationsmechanismus gab das interessante Ergebnis, dass die
Motilität von Cin8 stark durch die Bindung eines zweiten MT
beeinflusst wurde: in Puffer mit hoher Ionenstärke bewegte sich
Cin8 schnell und prozessiv in Richtung Minus-Ende eines einzelnen
MT und änderte seine Motilität schlagartig hin zu schnell
alternierender Direktionalität sobald ein zweiter, antiparalleler
MT gebunden wurde. Die Motilität mit alternierender Direktionalität
bewirkte gleichzeitig eine gleichmäßige relative Verschiebung des
zweiten MT in Richtung Plus-Ende. Dieses außergewöhnliche Verhalten
von Cin8 könnte bei der Regulation seiner unterschiedlichen
Funktionen in der mitotischen Spindel eine entscheidende Rolle
spielen. In Kapitel 3 wurde durch Einzelmolekül-Fluoreszenz
in-vitro-Experimente bestätigt, dass bei niedriger Ionenstärke
einzelne Cin8 Moleküle in der Lage sind, ihre Motilität
bidirektional umzuschalten. Mittels Intensitätsanalyse der
Kymographen von GFP-markierten Cin8 Motorproteinen in
Niedrigsalzpuffer konnte die von Roostalu et al. postulierte
Möglichkeit ausgeschlossen werden, dass Cluster-Formation der Cin8
Moleküle notwendig ist, um Motilität in Richtung Plus-Ende zu
initiieren. Die Ergebnisse bekräftigen die These, dass die
Direktionalität einzelner Cin8 Moleküle durch die Bindung von
Ladung reguliert wird und nicht durch mechanische Kopplung zwischen
zwei oder mehreren Motorproteinen. In Kapitel 4 wurde der Einfluss
des kinesin-5-Inhibitor-Moleküls Monastrol auf die Motordomäne von
kinesin-5 aus Xenopus laevis (Eg5) untersucht. Für diese Studie
wurde eine stabile, dimere kinesin-1 stalk/kinesin-5 head Chimaere
(Eg5Kin) konstruiert, die aus der Motordomäne und der
neck-linker-Region von Eg5 und der neck-coiled-coil-Region von
Drosophila melanogaster kinesin-1 (DmKHC) besteht. In
Einzelmolekül-Fluoreszenz Experimenten zeigte diese Chimaere - im
Gegensatz zu Wildtyp Eg5 - eine hohe Prozessivität und keinerlei
diffusive Moden in ihrer Motilität. Die Zugabe des Eg5-Inhibitors
Monastrol zu dem Einzelmolekül-Experiment führte zu einer Reduktion
der Länge der prozessiven Läufe, beeinflusste aber
überraschenderweise nicht die Geschwindigkeit von Eg5Kin. Eine
Reihe von Experimenten mit sukzessiv zunehmender
Monastrol-Konzentration ließ schließlich den Schluss zu, dass die
Bindung eines einzelnen Monastrol-Moleküls an ein Eg5Kin-Dimer
nicht ausreicht, um dessen prozessiven Lauf zu stoppen, sondern
dass die simultane Bindung von zwei Monastrol-Molekülen nötig ist,
um das Dimer zu inhibieren, d.h. seinen Lauf zu stoppen. In Kapitel
5 wurde der Einfluss der neck-linker-Länge auf die prozessive
Motilität von zwölf dimeren kinesin-1 stalk/kinesin-5 head
Chimaeren, die auf Eg5Kin basieren, untersucht. Bei diesen
Motorprotein-Konstrukten wurde die neck-linker-Länge variiert und
reichte von 9 Aminosäuren (AS) über die nativen 18 AS bis hin zu 21
AS des Wildtyp Eg5 neck-linker. Bei einer weiteren Chimaere wurden
3 Proline zu den nativen 18 AS von Eg5 hinzugefügt, um eine
artifizielle neck-linker-Verlängerung zu erzeugen. Mittels
Multi-Motor-Gleit-Experimenten mit TMR-markierten MTs wurde
zunächst bestätigt, dass alle Konstrukte aktive Motorproteine sind.
Mit Einzelmolekül-Fluoreszenz Experimenten und mit Experimenten in
einer optischen Falle wurden die Konstrukte auf Einzelmolekül-Level
bezüglich Geschwindigkeit, Lauflänge und Kraft getestet. Die
Experimente zeigten, dass weder die Geschwindigkeit noch die
erzeugte Kraft von der neck-linker-Länge abhing. Doch
interessanterweise hatte die neck-linker-Länge einen deutlichen
Einfluss auf die Lauflänge der unterschiedlichen Konstrukte: die
neck-linker-Länge nahe der nativen neck-linker-Länge von Eg5 (17
und 18 AS) ermöglichte Lauflängen, die zwei Mal so lang waren wie
die der Konstrukte mit 13 bis 16 AS. Um zu überprüfen ob nahe der
nativen neck-linker-Länge von Eg5 tatsächlich maximale Lauflängen
erzielt werden, wurden Konstrukte mit noch längeren
neck-linker-Längen (19 bis 21 AS) untersucht. Hierbei wurde in der
Tat eine Abnahme der Lauflänge mit Zunahme der neck-linker-Länge
festgestellt. Diese Ergebnisse stellen das kürzlich von Shastry et
al. postulierte einfache und generelle Model, in dem eine kurze
neck-linker-Länge zu der direktesten Kommunikation zwischen den
Motordomänen und damit zu den längsten Lauflängen führt, in Frage.
Stattdessen weisen die Ergebnisse darauf hin, dass unterschiedliche
kinesine mit unterschiedlichen Funktionen möglicherweise auch auf
unterschiedliche neck-linker-Längen optimiert sind. In Kapitel 6
wurde mittels einer tetrameren kinesin-1 head/kinesin-5 tail
Chimaere das Umschalten zwischen diffusiver und prozessiver
Motilität untersucht. Bei diesem chimaeren Motorprotein-Konstrukt
(DK4mer) wurde die Motordomäne von Xenopus l. Eg5 durch die
entsprechenden Teile von Drosophila m. kinesin-1 ersetzt, wodurch
ein schnelles, prozessives und MT-gleitendes Motorprotein erzeugt
wurde. Da in früheren Studien von Kapitein et al. gezeigt wurde,
dass die Motilität von Wildtyp Eg5 aus einer Kombination von
diffusiven und prozessiven Moden besteht, war das Ziel dieser
Studie, das Umschalten von diffusiver zu prozessiver Motilität
genauer zu untersuchen. Einzelmolekül-Fluoreszenz Experimente
zeigten, dass DK4mer sich in vitro entlang einzelner MTs schnell
und prozessive bewegt, wobei diese Bewegung durch diffusive Pausen
unterbrochen wurde. Wenn kein ATP im Motilitätspuffer enthalten
war, diffundierte DK4mer - ähnlich wie Eg5 - entlang eines
einzelnen MT. MT-Gleit-Experimenten zeigten, dass DK4mer in der
Lage war antiparallele MTs auseinander zu schieben, und bestätigten
damit, dass DK4mer ein vollfunktionales Tetramer ist. Im Vergleich
zu Eg5 waren bei DK4mer klare Unterschiede zwischen diffusiven und
prozessiven Motilitätsmoden zu erkennen, was es ermöglichte
Übergangsraten als Funktion der Ionenstärke im Motilitätspuffer zu
bestimmen. Die Ergebnisse dieser Studie deuten darauf hin, dass die
zwei Motilitätsmoden von DK4mer zwei unabhängigen und
möglicherweise einander ausschließenden Interaktionsmoden mit dem
MT entsprechen. Diese unterschiedlichen MT-Interaktionsmoden
könnten auch für die Regulation von nativen kinesin-5
Motorproteinen relevant sein. | de |
dc.format.mimetype | application/pdf | de |
dc.language.iso | eng | de |
dc.rights.uri | http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/ | de |
dc.title | Single-molecule experiments with mitotic motor proteins | de |
dc.type | doctoralThesis | de |
dc.title.translated | Einzelmolekül-Experimente mit mitotischen Motorproteinen | de |
dc.contributor.referee | Schmidt, Christoph F. Prof. Dr. | de |
dc.date.examination | 2012-09-28 | de |
dc.subject.dnb | 530 Physik | de |
dc.subject.gok | WCC 000 | de |
dc.description.abstracteng | This cumulative PhD thesis covers in five
chapters (chapters 2, 3, 4 and 5 consisting of published papers and
chapter 6 consisting of a submitted manuscript) new findings on
different aspects of the regulation of kinesin-5 motor proteins.
Outside the topic of kinesin-5 motor proteins, chapter 7 consists
of a paper about cellular motility of neuronal receptors to which I
contributed TIRF-microscopy in-vivo measurements in neurons. In
chapter 2, the factors that cause directional switching in Cin8,
one of the two kinesin-5 motor proteins from S. cerevisiae, were
studied. Until know the directionality of kinesin-5 motor proteins
was believed to be fixed and unidirectional to the plus-end of the
microtubule (MT). The findings presented here, and an independent
recent report from Roostalu et al., showed that surprisingly Cin8
is able to switch directionality. In the work presented here Cin8
directionality was examined using single-molecule fluorescence
motility experiments and live-cell microscopy. Single-molecule
fluorescence experiments revealed that individual Cin8 motor
proteins could be switched by ionic strength in the buffer solution
from fast and processive minus-end to slow plus-end motion on
single MTs. An even more interesting finding was that Cin8 motility
was strongly affected by binding to a second MT: at high ionic
strength in the buffer solution, Cin8 motor proteins moved fast and
processive on single MTs and switched to rapidly alternated
directionalities when bound between antiparallel MTs, while at the
same time driving steady plus-end relative sliding. This
extraordinary behaviour of Cin8 probably plays a crucial role in
the regulation of its different functions inside the mitotic
spindle. In chapter 3, the capability of single Cin8 molecules of
bi-directional switching in low-ionic-strength conditions was
confirmed in single-molecule fluorescence in-vitro studies. By
intensity analysis of kymographs from GFP-labelled Cin8 motor
proteins in low-salt buffer, the possibility that cluster formation
of Cin8 is necessary to induce plus-end directed motility, as
proposed by Roostalu et al., could be ruled out. These findings are
further evidence that the switching of directionality of single
Cin8 molecules is regulated via cargo binding rather then
mechanical coupling between two or more motor proteins. In chapter
4, the effect of the kinesin-5 inhibitor monastrol on the motor
domain of kinesin-5 from Xenopus laevis (Eg5) was investigated. In
this work we constructed a stable dimeric kinesin-1 stalk/kinesin-5
head chimera (Eg5Kin), which consists of the motor domain and neck
linker of Eg5 and the neck coiled coil of Drosophila melanogaster
kinesin-1 (DmKHC). Single-molecule fluorescence experiments showed
that this chimera, in contrast to Eg5, was highly processive and
exhibited no diffusive modes of motility. Adding the Eg5 inhibitor
monastrol to the single-molecule assays, resulted in reduced length
of processive runs, but surprisingly did not affect the velocity of
Eg5Kin. A set of experiments with successively increasing monastrol
concentrations then finally indicated that the binding of a single
monastrol molecule to an Eg5Kin dimer is not sufficient to stop its
processive run, but rather that the simultaneous binding of two
monastrol molecules is required to inhibit the dimer, i.e.
terminate its run. In chapter 5, the influence of the neck-linker
length on the processive motility of twelve dimeric kinesin-1
stalk/kinesin-5 head chimeras based on Eg5Kin was examined. In
these constructs, the neck-linker length ranged from 9 amino acids
(aa) over the native 18 aa up to 21 aa of the wild-type Eg5 neck
linker. In one additional chimera 3 prolines were added to the
native 18 aa of Eg5 to gain an artificial neck-linker elongation.
In multi-motor gliding assays all of the constructs were positively
tested to be active motor proteins. In single-molecule fluorescence
as well as in optical-trapping experiments the constructs were
further tested on a single-molecule level for velocity, run length
and force. The experiments showed that neither velocity nor force
generation was dependent on the neck-linker length. But
interestingly, the neck-linker lengths close to the native
neck-linker length (17 and 18 aa) allowed run lengths twice as long
as those of the constructs with 13 to 16 aa. To check if the run
length really peaks close to the native neck-linker length of Eg5
constructs with an even longer neck linker (19 to 21 aa) were
tested and a decrease in run length with increasing neck-linker
length was actually observed. These findings challenge the simple
model recently proposed by Shastry et al. in which a short neck
linker yields the tightest communication and hence the longest run
length, but suggest instead that different kinesins might be
optimised for different neck-linker lengths. In chapter 6, the
switching of a tetrameric kinesin-1 head/kinesin-5 tail chimera
between diffusive and processive motility was studied. In this
chimeric motor construct, named DK4mer, the motor domain from
Xenopus l. Eg5 was replaced by the respective parts from Drosophila
m. kinesin-1 resulting in a fast and processive MT-sliding motor.
Since wild type Eg5 was shown to exhibit a complex mixture of
diffusive and processive motility modes, the aim of this study was
to analyse the switching from diffusive to directed motility in
more detail. In single-molecule fluorescence in-vitro assays,
DK4mer exhibited fast processive motility on single MTs,
interrupted by diffusive pauses. When no ATP was present DK4mer
diffused along single MTs, similar to Eg5. In MT-sliding assays
DK4mer was able to slide antiparallel MTs apart confirming that it
is a fully functional tetramer. Compared to Eg5, DK4mer showed a
very clear distinction between diffusive and processive motility
modes which made it possible to measure transition rates as a
function of ionic-strength in the motility buffer. The findings in
this study indicate that the two motility modes of DK4mer reflect
two independent and possibly mutually exclusive modes of
interaction with MTs which are likely to be relevant for the
regulation of native kinesin-5 motors as well. | de |
dc.contributor.coReferee | Enderlein, Jörg Prof. Dr. | de |
dc.contributor.thirdReferee | Grubmüller, Helmut Prof. Dr. | de |
dc.subject.topic | Physics | de |
dc.subject.ger | Einzelmolekül-Fluoreszenzmikroskopie | de |
dc.subject.ger | TIRF-Mikroskopie | de |
dc.subject.ger | mitotische Motorproteine | de |
dc.subject.ger | Kinesin-5 | de |
dc.subject.ger | Regulation | de |
dc.subject.eng | single-molecule fluorescence microscopy | de |
dc.subject.eng | TIRF microscopy | de |
dc.subject.eng | mitotic motor proteins | de |
dc.subject.eng | Kinesin-5 | de |
dc.subject.eng | regulation | de |
dc.subject.bk | 42.12 | de |
dc.identifier.urn | urn:nbn:de:gbv:7-webdoc-3749-3 | de |
dc.identifier.purl | webdoc-3749 | de |
dc.affiliation.institute | Fakultät für Physik | de |
dc.identifier.ppn | 730759555 | de |