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dc.contributor.advisor Schmidt, Christoph F. Prof. Dr. de
dc.contributor.author Thiede, Christina de
dc.date.accessioned 2012-10-24T15:59:37Z de
dc.date.accessioned 2013-01-18T13:28:55Z de
dc.date.available 2013-01-30T23:51:07Z de
dc.date.issued 2012-10-24 de
dc.identifier.uri http://hdl.handle.net/11858/00-1735-0000-000D-F08F-D de
dc.description.abstract Die vorliegende kumulative Doktorarbeit beinhaltet in fünf Kapiteln (Kapitel 2, 3, 4, und 5 bestehend aus publizierten Veröffentlichungen und Kapitel 6 bestehend aus einem eingereichten Manuskript) neue Erkenntnisse über unterschiedlicher Aspekte der Regulation von mitotischen kinesin-5 Motorproteinen. Außerhalb des Themas der kinesin-5-Regulation besteht Kapitel 7 aus einer publizierten Veröffentlichung über zellulare Motilität neuronaler Rezeptoren, zu der ich in vivo Messungen in Neuronen mittels TIRF-Mikroskopie beigetragen habe. In Kapitel 2 wurden Faktoren untersucht, die Richtungsänderungen in Cin8 - eines der zwei kinesin-5 Motorproteine in Saccharomyces cerevisiae - verursachen. Bisher wurde angenommen, dass Motorproteinen eine bestimmte, feste Bewegungsrichtung durch ihre Molekularstruktur vorgegeben ist. Die gerichtete Bewegung von kinesin-5 erfolgt nach bisherigem Kenntnisstand stets und unidirektional in Richtung des Plus-Endes des Mikrotubulus (MT). Die hier präsentierten Ergebnisse und die von dieser Arbeit unabhängigen, zeitgleich veröffentlichen Daten einer aktuellen Studie von Roostalu et al. zeigten jetzt allerdings, dass Cin8 wider Erwarten in der Lage ist seine Bewegungsrichtung zu ändern. In der vorliegenden Studie wurde die Direktionalität von Cin8 in vitro mittels Einzelmolekül-Fluoreszenz in Motilitätsexperimenten und in vivo mittels live-cell-Mikroskopie untersucht. Die in-vitro-Experimente zeigten, dass die Bewegungsrichtung einzelner Cin8 Motorproteine entlang eines MT durch Verringerung der Ionenstärke im Puffer von schneller, prozessiver zum Minus-Ende gerichteter Bewegung zu langsamer zum Plus-Ende gerichteter Bewegung „umgeschaltet“ werden konnte. Hinweise auf einen physiologisch relevanteren Regulationsmechanismus gab das interessante Ergebnis, dass die Motilität von Cin8 stark durch die Bindung eines zweiten MT beeinflusst wurde: in Puffer mit hoher Ionenstärke bewegte sich Cin8 schnell und prozessiv in Richtung Minus-Ende eines einzelnen MT und änderte seine Motilität schlagartig hin zu schnell alternierender Direktionalität sobald ein zweiter, antiparalleler MT gebunden wurde. Die Motilität mit alternierender Direktionalität bewirkte gleichzeitig eine gleichmäßige relative Verschiebung des zweiten MT in Richtung Plus-Ende. Dieses außergewöhnliche Verhalten von Cin8 könnte bei der Regulation seiner unterschiedlichen Funktionen in der mitotischen Spindel eine entscheidende Rolle spielen. In Kapitel 3 wurde durch Einzelmolekül-Fluoreszenz in-vitro-Experimente bestätigt, dass bei niedriger Ionenstärke einzelne Cin8 Moleküle in der Lage sind, ihre Motilität bidirektional umzuschalten. Mittels Intensitätsanalyse der Kymographen von GFP-markierten Cin8 Motorproteinen in Niedrigsalzpuffer konnte die von Roostalu et al. postulierte Möglichkeit ausgeschlossen werden, dass Cluster-Formation der Cin8 Moleküle notwendig ist, um Motilität in Richtung Plus-Ende zu initiieren. Die Ergebnisse bekräftigen die These, dass die Direktionalität einzelner Cin8 Moleküle durch die Bindung von Ladung reguliert wird und nicht durch mechanische Kopplung zwischen zwei oder mehreren Motorproteinen. In Kapitel 4 wurde der Einfluss des kinesin-5-Inhibitor-Moleküls Monastrol auf die Motordomäne von kinesin-5 aus Xenopus laevis (Eg5) untersucht. Für diese Studie wurde eine stabile, dimere kinesin-1 stalk/kinesin-5 head Chimaere (Eg5Kin) konstruiert, die aus der Motordomäne und der neck-linker-Region von Eg5 und der neck-coiled-coil-Region von Drosophila melanogaster kinesin-1 (DmKHC) besteht. In Einzelmolekül-Fluoreszenz Experimenten zeigte diese Chimaere - im Gegensatz zu Wildtyp Eg5 - eine hohe Prozessivität und keinerlei diffusive Moden in ihrer Motilität. Die Zugabe des Eg5-Inhibitors Monastrol zu dem Einzelmolekül-Experiment führte zu einer Reduktion der Länge der prozessiven Läufe, beeinflusste aber überraschenderweise nicht die Geschwindigkeit von Eg5Kin. Eine Reihe von Experimenten mit sukzessiv zunehmender Monastrol-Konzentration ließ schließlich den Schluss zu, dass die Bindung eines einzelnen Monastrol-Moleküls an ein Eg5Kin-Dimer nicht ausreicht, um dessen prozessiven Lauf zu stoppen, sondern dass die simultane Bindung von zwei Monastrol-Molekülen nötig ist, um das Dimer zu inhibieren, d.h. seinen Lauf zu stoppen. In Kapitel 5 wurde der Einfluss der neck-linker-Länge auf die prozessive Motilität von zwölf dimeren kinesin-1 stalk/kinesin-5 head Chimaeren, die auf Eg5Kin basieren, untersucht. Bei diesen Motorprotein-Konstrukten wurde die neck-linker-Länge variiert und reichte von 9 Aminosäuren (AS) über die nativen 18 AS bis hin zu 21 AS des Wildtyp Eg5 neck-linker. Bei einer weiteren Chimaere wurden 3 Proline zu den nativen 18 AS von Eg5 hinzugefügt, um eine artifizielle neck-linker-Verlängerung zu erzeugen. Mittels Multi-Motor-Gleit-Experimenten mit TMR-markierten MTs wurde zunächst bestätigt, dass alle Konstrukte aktive Motorproteine sind. Mit Einzelmolekül-Fluoreszenz Experimenten und mit Experimenten in einer optischen Falle wurden die Konstrukte auf Einzelmolekül-Level bezüglich Geschwindigkeit, Lauflänge und Kraft getestet. Die Experimente zeigten, dass weder die Geschwindigkeit noch die erzeugte Kraft von der neck-linker-Länge abhing. Doch interessanterweise hatte die neck-linker-Länge einen deutlichen Einfluss auf die Lauflänge der unterschiedlichen Konstrukte: die neck-linker-Länge nahe der nativen neck-linker-Länge von Eg5 (17 und 18 AS) ermöglichte Lauflängen, die zwei Mal so lang waren wie die der Konstrukte mit 13 bis 16 AS. Um zu überprüfen ob nahe der nativen neck-linker-Länge von Eg5 tatsächlich maximale Lauflängen erzielt werden, wurden Konstrukte mit noch längeren neck-linker-Längen (19 bis 21 AS) untersucht. Hierbei wurde in der Tat eine Abnahme der Lauflänge mit Zunahme der neck-linker-Länge festgestellt. Diese Ergebnisse stellen das kürzlich von Shastry et al. postulierte einfache und generelle Model, in dem eine kurze neck-linker-Länge zu der direktesten Kommunikation zwischen den Motordomänen und damit zu den längsten Lauflängen führt, in Frage. Stattdessen weisen die Ergebnisse darauf hin, dass unterschiedliche kinesine mit unterschiedlichen Funktionen möglicherweise auch auf unterschiedliche neck-linker-Längen optimiert sind. In Kapitel 6 wurde mittels einer tetrameren kinesin-1 head/kinesin-5 tail Chimaere das Umschalten zwischen diffusiver und prozessiver Motilität untersucht. Bei diesem chimaeren Motorprotein-Konstrukt (DK4mer) wurde die Motordomäne von Xenopus l. Eg5 durch die entsprechenden Teile von Drosophila m. kinesin-1 ersetzt, wodurch ein schnelles, prozessives und MT-gleitendes Motorprotein erzeugt wurde. Da in früheren Studien von Kapitein et al. gezeigt wurde, dass die Motilität von Wildtyp Eg5 aus einer Kombination von diffusiven und prozessiven Moden besteht, war das Ziel dieser Studie, das Umschalten von diffusiver zu prozessiver Motilität genauer zu untersuchen. Einzelmolekül-Fluoreszenz Experimente zeigten, dass DK4mer sich in vitro entlang einzelner MTs schnell und prozessive bewegt, wobei diese Bewegung durch diffusive Pausen unterbrochen wurde. Wenn kein ATP im Motilitätspuffer enthalten war, diffundierte DK4mer - ähnlich wie Eg5 - entlang eines einzelnen MT. MT-Gleit-Experimenten zeigten, dass DK4mer in der Lage war antiparallele MTs auseinander zu schieben, und bestätigten damit, dass DK4mer ein vollfunktionales Tetramer ist. Im Vergleich zu Eg5 waren bei DK4mer klare Unterschiede zwischen diffusiven und prozessiven Motilitätsmoden zu erkennen, was es ermöglichte Übergangsraten als Funktion der Ionenstärke im Motilitätspuffer zu bestimmen. Die Ergebnisse dieser Studie deuten darauf hin, dass die zwei Motilitätsmoden von DK4mer zwei unabhängigen und möglicherweise einander ausschließenden Interaktionsmoden mit dem MT entsprechen. Diese unterschiedlichen MT-Interaktionsmoden könnten auch für die Regulation von nativen kinesin-5 Motorproteinen relevant sein. de
dc.format.mimetype application/pdf de
dc.language.iso eng de
dc.rights.uri http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/ de
dc.title Single-molecule experiments with mitotic motor proteins de
dc.type doctoralThesis de
dc.title.translated Einzelmolekül-Experimente mit mitotischen Motorproteinen de
dc.contributor.referee Schmidt, Christoph F. Prof. Dr. de
dc.date.examination 2012-09-28 de
dc.subject.dnb 530 Physik de
dc.subject.gok WCC 000 de
dc.description.abstracteng This cumulative PhD thesis covers in five chapters (chapters 2, 3, 4 and 5 consisting of published papers and chapter 6 consisting of a submitted manuscript) new findings on different aspects of the regulation of kinesin-5 motor proteins. Outside the topic of kinesin-5 motor proteins, chapter 7 consists of a paper about cellular motility of neuronal receptors to which I contributed TIRF-microscopy in-vivo measurements in neurons. In chapter 2, the factors that cause directional switching in Cin8, one of the two kinesin-5 motor proteins from S. cerevisiae, were studied. Until know the directionality of kinesin-5 motor proteins was believed to be fixed and unidirectional to the plus-end of the microtubule (MT). The findings presented here, and an independent recent report from Roostalu et al., showed that surprisingly Cin8 is able to switch directionality. In the work presented here Cin8 directionality was examined using single-molecule fluorescence motility experiments and live-cell microscopy. Single-molecule fluorescence experiments revealed that individual Cin8 motor proteins could be switched by ionic strength in the buffer solution from fast and processive minus-end to slow plus-end motion on single MTs. An even more interesting finding was that Cin8 motility was strongly affected by binding to a second MT: at high ionic strength in the buffer solution, Cin8 motor proteins moved fast and processive on single MTs and switched to rapidly alternated directionalities when bound between antiparallel MTs, while at the same time driving steady plus-end relative sliding. This extraordinary behaviour of Cin8 probably plays a crucial role in the regulation of its different functions inside the mitotic spindle. In chapter 3, the capability of single Cin8 molecules of bi-directional switching in low-ionic-strength conditions was confirmed in single-molecule fluorescence in-vitro studies. By intensity analysis of kymographs from GFP-labelled Cin8 motor proteins in low-salt buffer, the possibility that cluster formation of Cin8 is necessary to induce plus-end directed motility, as proposed by Roostalu et al., could be ruled out. These findings are further evidence that the switching of directionality of single Cin8 molecules is regulated via cargo binding rather then mechanical coupling between two or more motor proteins. In chapter 4, the effect of the kinesin-5 inhibitor monastrol on the motor domain of kinesin-5 from Xenopus laevis (Eg5) was investigated. In this work we constructed a stable dimeric kinesin-1 stalk/kinesin-5 head chimera (Eg5Kin), which consists of the motor domain and neck linker of Eg5 and the neck coiled coil of Drosophila melanogaster kinesin-1 (DmKHC). Single-molecule fluorescence experiments showed that this chimera, in contrast to Eg5, was highly processive and exhibited no diffusive modes of motility. Adding the Eg5 inhibitor monastrol to the single-molecule assays, resulted in reduced length of processive runs, but surprisingly did not affect the velocity of Eg5Kin. A set of experiments with successively increasing monastrol concentrations then finally indicated that the binding of a single monastrol molecule to an Eg5Kin dimer is not sufficient to stop its processive run, but rather that the simultaneous binding of two monastrol molecules is required to inhibit the dimer, i.e. terminate its run. In chapter 5, the influence of the neck-linker length on the processive motility of twelve dimeric kinesin-1 stalk/kinesin-5 head chimeras based on Eg5Kin was examined. In these constructs, the neck-linker length ranged from 9 amino acids (aa) over the native 18 aa up to 21 aa of the wild-type Eg5 neck linker. In one additional chimera 3 prolines were added to the native 18 aa of Eg5 to gain an artificial neck-linker elongation. In multi-motor gliding assays all of the constructs were positively tested to be active motor proteins. In single-molecule fluorescence as well as in optical-trapping experiments the constructs were further tested on a single-molecule level for velocity, run length and force. The experiments showed that neither velocity nor force generation was dependent on the neck-linker length. But interestingly, the neck-linker lengths close to the native neck-linker length (17 and 18 aa) allowed run lengths twice as long as those of the constructs with 13 to 16 aa. To check if the run length really peaks close to the native neck-linker length of Eg5 constructs with an even longer neck linker (19 to 21 aa) were tested and a decrease in run length with increasing neck-linker length was actually observed. These findings challenge the simple model recently proposed by Shastry et al. in which a short neck linker yields the tightest communication and hence the longest run length, but suggest instead that different kinesins might be optimised for different neck-linker lengths. In chapter 6, the switching of a tetrameric kinesin-1 head/kinesin-5 tail chimera between diffusive and processive motility was studied. In this chimeric motor construct, named DK4mer, the motor domain from Xenopus l. Eg5 was replaced by the respective parts from Drosophila m. kinesin-1 resulting in a fast and processive MT-sliding motor. Since wild type Eg5 was shown to exhibit a complex mixture of diffusive and processive motility modes, the aim of this study was to analyse the switching from diffusive to directed motility in more detail. In single-molecule fluorescence in-vitro assays, DK4mer exhibited fast processive motility on single MTs, interrupted by diffusive pauses. When no ATP was present DK4mer diffused along single MTs, similar to Eg5. In MT-sliding assays DK4mer was able to slide antiparallel MTs apart confirming that it is a fully functional tetramer. Compared to Eg5, DK4mer showed a very clear distinction between diffusive and processive motility modes which made it possible to measure transition rates as a function of ionic-strength in the motility buffer. The findings in this study indicate that the two motility modes of DK4mer reflect two independent and possibly mutually exclusive modes of interaction with MTs which are likely to be relevant for the regulation of native kinesin-5 motors as well. de
dc.contributor.coReferee Enderlein, Jörg Prof. Dr. de
dc.contributor.thirdReferee Grubmüller, Helmut Prof. Dr. de
dc.subject.topic Physics de
dc.subject.ger Einzelmolekül-Fluoreszenzmikroskopie de
dc.subject.ger TIRF-Mikroskopie de
dc.subject.ger mitotische Motorproteine de
dc.subject.ger Kinesin-5 de
dc.subject.ger Regulation de
dc.subject.eng single-molecule fluorescence microscopy de
dc.subject.eng TIRF microscopy de
dc.subject.eng mitotic motor proteins de
dc.subject.eng Kinesin-5 de
dc.subject.eng regulation de
dc.subject.bk 42.12 de
dc.identifier.urn urn:nbn:de:gbv:7-webdoc-3749-3 de
dc.identifier.purl webdoc-3749 de
dc.affiliation.institute Fakultät für Physik de
dc.identifier.ppn 730759555 de

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