dc.contributor.advisor | Fischle, Wolfgang Prof. Dr. | de |
dc.contributor.author | Stützer, Alexandra | de |
dc.date.accessioned | 2012-04-12T18:34:12Z | de |
dc.date.accessioned | 2013-01-18T14:24:12Z | de |
dc.date.available | 2013-01-30T23:51:09Z | de |
dc.date.issued | 2012-04-12 | de |
dc.identifier.uri | http://hdl.handle.net/11858/00-1735-0000-000D-F0AF-5 | de |
dc.identifier.uri | http://dx.doi.org/10.53846/goediss-3207 | |
dc.description.abstract | Zwei grundsätzliche Assemblierungswege
sorgen für die korrekte Weitergabe von Chromatinstrukturen und
Chromatin-basierender Informationen während des Zellzyklus. Ein
replikationsabhängiger (RA) Weg, bei dem die Assemblierung an die
DNA-Synthese gekoppelt ist und eine replikationsunabhängiger (RU)
Weg. Inwiefern beide Prozesse zur Etablierung von spezialisierten
Chromatinbereichen, wie Heterochromatin und Euchromatin, durch
post-translationale Modifizierungen an Histonproteinen oder
Veränderungen der Chromatinstruktur beitragen, ist nicht bekannt.
Mit Hilfe von Xenopus laevis Eiextrakten wurde die RA und RU
Chromatinassemblierung auf einzel- bzw. doppelsträngiger DNA
untersucht. Obwohl der RA Assemblierungsprozess schneller ablief,
enthalten beide Chromatinspezies vergleichbare Mengen an Histonen
und einen ähnlichen Saturierungsgrad an Nukleosomen. Trotz dieser
vergleichbaren topologischen Eigenschaften, zeigen die beiden
erzeugten Chromatinarten ein unterschiedliches Verhalten in
Sucrosedichtegradienten. Hierbei reicherte sich das RA-erzeugte
Chromatin bei niedrigeren Sucrosekonzentrationen an, was
Rückschlüsse auf eine unterschiedliche Kompaktierung des Chromatins
zulässt. AFM Studien bestätigten, dass beide Chromatinspezies
diskrete Strukturen ausbildeten. Als nächstes wurde die
biochemische Zusammensetzung des RA und RU erzeugten Chromatins
analysiert. Massenspektrometrische Analysen von
Chromatin-assoziierten Proteinen zeigten, dass es unterschiedlichen
Gruppen von Proteinen gibt, die entweder in beiden Prozessen oder
nur einem von beiden eine Rolle spielen. Die Histonvariante H3.3
zum Beispiel wurde ausschließlich während der RU Assemblierung
inkorporiert. Im Gegensatz dazu konnten die Histonvarianten H3.2
und H2A.Z als Bestandteile beider Assemblierungswege identifiziert
werden. Innerhalb des RU Assemblierungsweges konnten außerdem
Methylierung von H3K4 und Monomethylierung von H4K20 gefunden
werden. Keine dieser Methylierungsmuster konnte während der RA
Chromatinassemblierung nachgewiesen werden. Der Einbau der
Methylierungen scheint unabhängig voneinander stattzufinden, denn
die Monomethylierung von H4K20 durch PR-Set7 fand unabhängig von
bereits vorhandener H3K4 Methylierung statt. Desweiteren kann eine
Rekrutierung von PR-Set7 zum Assemblierungsvorgang durch HIRA, dem
zentralen Protein des RU Assemblierungsweges, ausgeschlossen
werden. Immunopräzipitationstudien dagegen zeigten, dass HIRA im
Eiextrakt mit einer H3K4 Methyltransferase assoziiert. Die
beschriebenen biochemischen Unterschiede legten die Vermutung nahe,
dass auch Unterschiede auf transkriptioneller und demnach
funktioneller Ebene bestehen könnten. Die Transkriptionsanalyse von
extrahierten Chromatin belegte, dass der RU Assemblierungsweg zu
transkriptionell aktiven Chromatin führte, wogegen RA-erzeugtes
Chromatin nicht transkriptionell zugängig war. Die Blockierung
jeglicher Methylierung durch SAH veränderte dabei nicht nur die
Struktur des RU assemblierten Chromatins, sondern reduzierte auch
dessen transkriptionelle Aktivität. Zusammenfassend konnte in
dieser Arbeit gezeigt werden, dass die RA und RU Assemblierungswege
Chromatinspezies generiert, welche sich auf struktureller,
biochemischer und funktionaler Ebene unterscheiden. Die de novo
Assemblierung während der Replikation erzeugt eine transkriptionell
inaktive Chromatinstruktur im Gegensatz zum transkriptionell
aktiven Chromatin des RU Assemblierungsweges. Die Tatsache das RU
Chromatinassemblierung außerhalb der S-Phase stattfindet, legt nahe
dass dieser Prozess dafür genutzt werden kann, um die
transkriptionelle Aktivität bestimmter genomischer Regionen nach
Ende der S-Phase wiederherzustellen. | de |
dc.format.mimetype | application/pdf | de |
dc.language.iso | eng | de |
dc.rights.uri | http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/ | de |
dc.title | Biochemical and functional differences of chromatin assembled replication-coupled or independent in Xenopus laevis egg extracts | de |
dc.type | doctoralThesis | de |
dc.title.translated | Biochemische und funktionelle Unterschiede von Chromatin assembliert replikationsabhängig oder -unabhängig in Xenopus laevis Eiextrakten | de |
dc.contributor.referee | Fischle, Wolfgang Prof. Dr. | de |
dc.date.examination | 2011-06-07 | de |
dc.subject.dnb | 570 Biowissenschaften | de |
dc.subject.dnb | Biologie | de |
dc.subject.gok | WF200 | de |
dc.subject.gok | WHC300 | de |
dc.description.abstracteng | Two main chromatin assembly pathways
ensure the proper transmission of chromatin organization and
chromatin-based information throughout the cell cycle. A
replication-dependent (RD) pathway that couples chromatin assembly
to DNA synthesis and a replication-independent (RI) pathway.
Whether these pathways contribute to the establishment of chromatin
domains like heterochromatin or euchromatin by introducing
modifications on histones or modulating chromatin structure remains
unknown. Using Xenopus laevis egg extracts we monitored RD and RI
chromatin assembly on single-stranded and double-stranded DNA
templates. Even though RD assembly proceeded faster than RI
assembly the histone content and saturation level with nucleosomes
were similar. Despite these comparable topological features, the
hydrodynamic behavior of both chromatin species in sucrose gradient
centrifugation clearly differed. The RD assembled chromatin ran at
lower sucrose concentrations than the RI created chromatin
suggesting different compaction levels of the generated chromatin
fibers. AFM studies confirmed that both chromatin species formed
discrete higher order structures. Next, we analyzed the underlying
biochemical composition of the RD and RI derived chromatin. Mass
spectrometry analysis of chromatin-associated proteins revealed
distinct subsets of proteins associated either with both or one of
the pathways. For example, the histone variant H3.3 was exclusively
incorporated during RI assembly. In contrast, the variants H3.2 and
H2A.Z were confirmed as components of both chromatin species.
Within the RI assembly pathway we detected pronounced methylation
of H3K4 and monomethylation of H4K20. None of these methyl marks
was found on the RD assembled material. The installation of the
methyl marks did not seem to depend on each other. PR-Set7, the
H4K20 monomethyltransferase, methylated chromatin independent of
H3K4 methylation. Furthermore, PR-Set7 was not directly targeted to
chromatin by HIRA, the key chaperone during RI assembly. Instead,
using immunoprecipitation we found that HIRA is complexed with an
H3K4 methyltransferase in the egg extract. The observed biochemical
differences raised the question whether the transcriptional and
thus functional competence of both chromatin species were also
different. Transcriptional analysis of purified chromatin revealed
that the RI assembly pathway resulted in transcriptional active
chromatin whereas the RD generated chromatin was refractory to
transcription. Blocking methylation with SAH led to a change in RI
assembled chromatin structure and to a reduction of its
transcriptional activity demonstrating the influence of these
methyl marks for the transcriptional read-out. In summary, we could
demonstrate that the RD and RI chromatin assembly pathway generate
chromatin species that differ on the structural, biochemical and
functional level. Whereas the de novo assembly during replication
produces a silenced chromatin fiber, RI assembled chromatin is
transcriptional active. Since RI assembly occurs outside of S-phase
we believe that it thereby enables the cell to restore the
transcriptional competence of certain genomic regions after
S-phase. | de |
dc.contributor.coReferee | Lührmann, Reinhard Prof. Dr. | de |
dc.contributor.thirdReferee | Pieler, Tomas Prof. Dr. | de |
dc.subject.topic | Göttingen Graduate School for Neurosciences and Molecular Biosciences (GGNB) | de |
dc.subject.ger | Chromatin | de |
dc.subject.ger | Chromatinassemblierung | de |
dc.subject.ger | Xenopus laevis Eiextrakt | de |
dc.subject.ger | Histonmodifikationen | de |
dc.subject.ger | Histonvarianten | de |
dc.subject.ger | PR-Set7 | de |
dc.subject.ger | HIRA | de |
dc.subject.eng | chromatin | de |
dc.subject.eng | chromatin assembly pathways | de |
dc.subject.eng | Xenopus laevis egg extract | de |
dc.subject.eng | histone modification | de |
dc.subject.eng | histone variants | de |
dc.subject.eng | PR-Set7 | de |
dc.subject.eng | HIRA | de |
dc.subject.bk | 35.70 | de |
dc.subject.bk | 42.13 | de |
dc.identifier.urn | urn:nbn:de:gbv:7-webdoc-3463-1 | de |
dc.identifier.purl | webdoc-3463 | de |
dc.affiliation.institute | Göttinger Graduiertenschule für Neurowissenschaften und Molekulare Biowissenschaften (GGNB) | de |
dc.identifier.ppn | 716181525 | de |