Regulators of Ubiquitin Dependent Protein Degradation in the Filamentous Fungus Aspergillus nidulans: Insights into CsnB, DenA and CandA Function
Regulatoren der Ubiquitin abhängigen Protein Degradation in dem filamentösen Pilz Aspergillus nidulans: Einblicke in die Funktion von CsnB, DenA und CandA
von Elke Ute Schwier
Datum der mündl. Prüfung:2008-01-24
Erschienen:2008-02-21
Betreuer:Prof. Dr. Gerhard Braus
Gutachter:Prof. Dr. Stefanie Pöggeler
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Format:PDF
Description:Dissertation
Zusammenfassung
Englisch
Ubiquitin dependent protein degradation is a central mechanism regulating multiple functions in cells. Ubiquitination of target proteins requires an enzyme cascade including ubiquitin ligases (E3s). One group of E3s contains cullins as the core component. Activity of these cullin containing E3s is modulated by the covalent modification of cullin with the ubiquitin like protein Nedd8. In this work three regulators of cullin containing E3s were studied in the fungus Aspergillus nidulans. (i) The COP9 signalosome (CSN) possess an enzyme activity that deneddylates cullins. Csn2/CsnB, the second subunit of the CSN, mediates the binding of the complex to ubiquitin ligases in mammals via binding to cullin. This study shows that the fungal CsnB interacts with CulD, suggesting a conserved function of the protein. Deletion of csnB leads, like deletion of the genes for other subunits of the CSN such as csnA, csnD or csnE, to a typical csn-deletion phenotype including red pigment formation and a block in sexual development. These results support the notion that all subunits of the complex are crucial for the deneddylase function. (ii) The putative mammalian Den1 homolog of the fungus (DenA) was proven to exhibit deneddylase activity in vivo. For the first time, this deneddylase was successfully deleted in an organism. Loss of denA in A. nidulans leads to a reduction of asexual development and an increased production of sexual structures. (iii) Mammalian Cand1 binds to cullins, thereby influencing the assembly of cullin containing E3s. In Aspergilli, the corresponding gene is split into two independent open reading frames encoding the N- and C-terminal part (candA-N, candA-C) of the mammalian homolog. Deletion of the single or both candA genes leads to mutants with identical phenotypes. They produce only few asexual spores, are blocked in early sexual development and appear dark red when grown under development inducing conditions. All defects of the candA deletion mutants can be complemented by a candA-N:: C fusion construct indicating that the split is not crucial for protein functions. Only CandA-C, but not CandA-N, binds to cullins. Since both CandA proteins interact with each other, binding of CandA-N to cullin is presumably mediated by CandA-C. CandA-C is nuclear enriched and expressed in vegetative cultures but degraded at an early stage of sexual development indicating a role during onset of development. The culture filtrate of both candA and csnE deletion mutants contains orsellinic acid related substances suggesting a connection of CandA and CsnE to the regulation of secondary metabolism. This study shows that the three regulators described are crucial for fungal development, indicating that fungi are useful models to analyze the interplay between cullin containing E3 activity and differentiation.
Keywords: protein degradation; ubiquitin ligase; deneddylation; Nedd8; CSN; DenA; CandA
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Ubiquitin-abhängiger Proteinabbau ist ein
zentraler Mechanismus zur Regulation verschiedenster
Zellfunktionen. Ubiquitinierung von Zielproteinen benötigt eine
Enzym- kaskade, zu der die Ubiquitin-Ligasen (E3s) gehören. Eine
Gruppe der E3s enthält Cullin als zentrale Komponente. Die
Aktivität dieser E3s wird durch kovalente Modifikation des Cullins
mit dem Ubiquitin-ähnlichen Protein Nedd8 beeinflusst. In dieser
Arbeit wurden drei Regulatoren von Cullin-enthaltenden E3s in
Aspergillus nidulans untersucht. (i) Das COP9 Signalosom
(CSN) ist in der Lage, Culline zu deneddylieren. Csn2/CsnB bindet
an Culline und vermittelt in Säugerzellen den Kontakt zu E3s. Diese
Arbeit zeigt, dass pilzliches CsnB mit CulD interagiert, was eine
konservierte Funktion des Proteins nahelegt. Die Deletion von
csnB führt, wie auch die Deletion von anderen CSN
Untereinheiten wie csnA, csnD oder csnE, zu
einem für csn-Mutanten typischen Phänotyp. Dieser zeichnet
sich durch die Bildung eines roten Farbstoffs und eine
unvollständige sexuelle Entwicklung aus. Diese Ergebnisse
unterstützen die Annahme, dass alle Untereinheiten für ein intaktes
CSN benötigt werden. (ii) Es wurde gezeigt, dass DenA, das A.
nidulans Homolog des Den1 aus Säugetieren, in vivo
Deneddylaseaktivität besitzt. A. nidulans ist der erste
Organismus in dem denA deletiert wurde. Die Deletionsmutante
zeigt eine verminderte asexuelle Entwicklung und die vermehrte
Produktion von sexuellen Strukturen. (iii) Cand1 aus Säugern bindet
an Cullin, wodurch es den Zusammenbau der E3s beeinflusst. In
Aspergillen ist das entsprechende Gen in zwei unabhängige
offene Leserahmen geteilt, die den N- und C-terminalen Teil
(candA-N, candA-C) des menschlichen Homologs
codieren. Die Deletion von einem oder beiden candA Genen
führt zu Mutanten mit identischen Phänotypen. Sie produzieren nur
wenig asexuelle Sporen, sind in der frühen sexuellen Entwicklung
blockiert und sind dunkelrot wenn sie unter
Entwicklungs-induzierenden Bedingungen angezogen werden. Da alle
Defekte der candA Mutante durch die Integration eines
candA-N::C Fusionskonstrukts komplementiert werden können,
ist die Trennung der CandA Proteine für ihre Funktion
offensichtlich nicht essentiell. Nur CandA-C, aber nicht CandA-N
bindet an Culline. Da beide CandA Proteine miteinander
interagieren, wird die Bindung von CandA-N an Cullin vermutlich
durch CandA-C vermittelt. CandA-C sammelt sich im Zellkern an und
hat vermutlich eine Funktion am Beginn der Entwicklung, da es in
vegetativen Kulturen exprimiert aber zu Beginn der sexuellen
Entwicklung abgebaut wird. Das Kulturfiltrat der candA und
csnE Mutanten enthält Substanzen die sich von Orsellinsäure
ableiten lassen, so dass sich eine Verbindung von CandA und CsnE zu
der Regulation des Sekundärmetabolismus vermuten lässt. Diese
Arbeit beschreibt die Wichtigkeit der drei untersuchten E3
Regulatoren für die pilzliche Entwicklung und zeigt
Aspergillus als nützliches Modell zur Analyse der
Wechselwirkung zwischen E3-Aktivität und Differenzierung.
Schlagwörter: Protein Degradation; Ubiquitin Ligase; Deneddylierung; Nedd8; CSN; DenA; CandA