Unraveling the structure of monomeric and fibrilized 441-residue tau with NMR spectroscopy

Abstract

Das Mikrotubuli-stabilisierende, intrinisch ungeordnete Protein tau ist für den axonalen Transport in Neuronen verantwortlich. Das binden an und das lösen von den Mikrotubuli wird durch ein komplexes Gleichgewicht von Phosphorylierung und Dephosphorylierung reguliert. Zusätzlich konnte ein klarer Zusammenhang zwischen der Alzheimerschen Krankkheit (AK) und tau etabliert werden. Tau-vermittelte neurodegenerative Erkrankungen sind durch unlösliche tau-Aggregate charakterisiert, sogenannten „paired helical filaments“, welche sich zu „neurofibrillären Geflechten“ zusammenlagern. Es ist jedoch unklar, welche extra- oder intrazellulären Faktoren die Umwandlung von einem physiologisch relevanten Protein zu einem Pathogen induzieren. In der vorliegenden Arbeit werden verschiedene Aspekte des Tau Proteins mittels NMR Spektroskopie untersucht. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde die tertiäre Struktur des Tau Proteins mithilfe von paramagnetischen Relaxationsexperimenten untersucht. Die dabei erhaltenen 2288 interatomaren Distanzen wurden für Ensemble-Strukturberechnungen benutzt, welche in ein Reste-spezifisches Modell resultierten. Der zweite Teil der Arbeit untersucht die derzeitige Leistungsfähigkeit von „disorder predictors“, Programme zur Vorhersage von Eigenschaften von ungeordneten Proteinen. Eine gute Vorhersage von intramolekularen Kontakten konnte durch IUPred erreicht werden, welche gut mit der experimentell ermittelten intramolekularen Kontaktkarte korrelierte. Protein-Protein-Bindungssstellen wurden mit ANCHOR vorhergesagt, welche sehr gut mit den Tau-Mikrotubuli Bindungsstellen übereinstimmten. Für die Sekundärstrukturvorhersage wurde ein Kombination von Programmen benutzt, welche letztendlich die korrekten Sekundärstrukturen für die höchsten experimentell ermittelten Sekundärstrukturwahrscheinlichkeiten prognostizierten. Das Auftreten von paired helical filaments ist immer mit deren Hyperphosphorylierung verbunden. Um unspezifische und partielle Phosphorylierung zu vermeiden wurde der hyperphosphorylierte Zustand simuliert, indem Serine und Threonine durch Glutaminsäure ersetzt wurden. Wir pseudophosphorylierten Serine und Threonine in AK-spezifischen Epitopen (AT8, AT100 und PHF1). Wir untersuchten dann, inwiefern sich die globale und lokale Struktur dieses pseudophosphorylierten Tau-Proteins veränderten. Wir konnten zeigen, dass Pseudophosphorylierung zu einem Öffnen der „paper-clip“ Struktur führte. Die Wichtigkeit von transienten langreichweitigen Wechselwirkungen wird dadurch unterstrichen, da genau diese Mutante eine höhere Aggregationsrate besitzt Die Abschwächung der transienten langreichweitigen intramolekularen Wechselwirkungen geschieht vor lokalen Strukturänderungen. Im vierten Teil dieser Arbeit untersuchten wir die fuzzy coat der paired helical filaments mit NMR. Aufgrund der Größe der Aggregate nutzten wir „high-resolution magic angle spinning“. Wir sahen eine hoch dynamische N-terminale (Reste 1M-T212) und C-terminale fuzzy coat (Reste 399V-L441), welche transient mit dem Fibrillenkern wechselwirkt. Der N-terminus zeigte eine verstärkte elektrostatische Wechselwirkung mit dem Fibrillenkern. Das erklärt die Bindung von konformations-spezifischen Antikörpern an das Tau-Protein mit zwei diskontinuierlichen Epitopen am N-terminus und am Fibrillenkern.