Die Charakterisierung der induzierbaren Stickstoffmonoxidsynthase im murinen RENCA-Nierenzellkarzinommodell unter spezieller Berücksichtigung tumorassoziierter Makrophagen, der Gefäßdichte und Tumorhypoxie
Characterization of inducible nitric oxide synthase in murine renal cell carcinoma considering of tumor associated macrophages, vessel distance and tumor hypoxia
by Juliane Franziska Krösel
Date of Examination:2013-03-11
Date of issue:2013-03-06
Advisor:PD Dr. Bernhard Hemmerlein
Referee:Prof. Dr. Frauke Alves
Referee:Prof. Dr. Patricia Virsik-Köpp
Persistent Address:
http://dx.doi.org/10.53846/goediss-3763
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Abstract
English
Objective. To characterize a murine renal cell carcinoma model considering hypoxia inducible tumor necrosis, macrophage infiltration as well as expression and activity level of iNOS. Methods. In vitro cultivated RENCA-cells were injected subcutaneously into Balb/c mice to obtain local tumor growth. To quantify the macrophage infiltrate and to characterize hypoxia in tumor tissue immunhistochemistry was used. For the location and quantity of nitric oxide activity immunhistochemistry and real-time reverse transcription-polymerase chain reaction were used. The Griess-reaction was used to determine the concentration of nitrite in tumor samples. Results. Spontaneously developed hypoxic tumor necrosis is associated with a significant lesser vessel distance. Necrosis extent correlates with tumor age. Elderly tumors (28 days) are showing a higher macrophage infiltrate than younger tumors (12-19 days). Although iNOS-expression in protein level shows no significant difference in elderly or younger tumors, observations could be made that there is a significant higher iNOS-expression in mRNA level in elderly tumors. In regard to αActinin-4 expression no significant differences could be seen. Conclusion. With nearly the same expression of iNOS and αActinin-4 respectively higher expression of iNOS-mRNA the concentration of nitrite in tumor tissue with hypoxic necrosis is reduced. We conclude that the activity of nitric oxide synthase under hypoxic conditions is reduced. These findings are in accordance to the thesis that there is a normoxic based association between αActinin-4 and iNOS which is regulating the iNOS activity. Therefore inhibition of iNOS could be a pathway which inhibits zytotoxicity of tumor associated macrophages through hypoxia. The reduced vessel distance in elderly tumors could probably be the result from vessel regression. There might be macrophage dependent cytokines which promote vessel regression.
Keywords: inducible nitric oxide synthase; tumor hypoxia; murine renal cell carcinoma; iNOS expression; macrophage infiltrate; vessel distance; tumor associated macrophages; tumor necrosis
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Einleitung: Ziel dieser Arbeit war es, das RENCA-Nierenzell-Karzinommodell anhand der Hypoxie-induzierten Nekrosen, der Makrophageninfitration sowie der iNOS-Expression und –aktivität zu charakterisieren.
Methoden: Für die Erzeugung lokaler Tumoren, wurden Balb/c-Mäusen in vitro kultivierte RENCA-Zellen subkutan appliziert. Die Quantifizierung des Makrophageninfiltrates sowie die Charakterisierung der Hypoxie im Tumorgewebe erfolgten mittels immunhistochemischer Färbungen. Für die Darstellung der Stickstoffmonoxid-Aktivität kamen neben der Immunhistochemie die Reverse Transkriptase Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) zur Anwendung. Der Nitrit-Gehalt der Tumorproben wurde mittels Griess-Reaktion bestimmt.
Ergebnisse: Spontan hypoxische Tumornekrosen sind assoziiert mit einer signifikant geringeren Gefäßdichte. Das Ausmaß der Nekrosen korreliert mit dem Alter der Tumoren. Alte Tumoren (28 Tage) zeigen eine höhere Makrophageninfiltration als junge Tumoren (12 bis 19 Tage). Obwohl die iNOS-Expression auf Proteinebene keinen signifikanten Unterschied zwischen alten und jungen Tumoren ergab, findet sich auf mRNA-Ebene eine signifikant erhöhte iNOS-Expression in alten Tumoren. Hinsichtlich der αActinin-4-Expression konnte kein signifikanter Unterschied gesehen werden.
Schlussfolgerung: Bei annähernd gleicher iNOS- und αActinin-4-Expression beziehungsweise erhöhter iNOS-mRNA-Expression ist die Konzentration an Nitrit in Tumoren mit hypoxischer Nekrose reduziert. Daraus kann man schließen, dass die Aktivität der NO-Synthase unter hypoxischen Bedingungen reduziert ist. Dies stützt wiederum die Vermutung, einer die iNOS-Aktivität steuernden normoxie-abhängigen Assoziation von αActinin-4 und iNOS. Die Aktivitätsinhibierung der iNOS könnte somit ein Mechanismus sein, durch den Hypoxie die Zytotoxizität von TAM inhibiert. Die abnehmende Gefäßdichte mit zunehmendem Tumoralter könnte möglicherweise auf eine Regression der Tumorgefäße zurückzuführen sein. Denkbar wäre, dass die Gefäßregression durch makrophagenabhängige Zytokine begünstigt wird.
Schlagwörter: induzierbare Stickstoffmonoxidsynthase; Tumorhypoxie; murines Nierenzellkarzinom; iNOS-Expression; Makrophageninfiltration; Gefäßdichte; tumorassoziierte Makrophagen; Tumornekrose