Organisation, Expression und Funktion des humanen Peroxisomal-Testis-Specific-1(PXT1)-Gens
Organization, expression and function of the human peroxisomal testis-specific-1 (PXT1) gene
by Agneta Auer
Date of Examination:2013-06-10
Date of issue:2013-05-29
Advisor:Prof. Dr. Dr. Wolfgang Engel
Referee:Prof. Dr. Wolfgang Engel
Referee:Prof. Dr. Jörg Großhans
Files in this item
Name:SUB_Dissertation_Agneta Auer.pdf
Size:1.76Mb
Format:PDF
Abstract
English
In this work, organization, expression and function of the human Peroxisomal Testis-specific 1 (PXT1) gene were investigated. The mRNA of the human PXT1 gene doesn’t contain two exons as known so far, but five exons. The expression of three putative upstream exons was confirmed in this work. The results of the qualitative and quantitative real-time PCR show that the exon 1 consists of three variously spliced units (exons 1a, 1b and 1c). The human PXT1 gene is subjected to alternative splicing, of which exons 1b, 1c, 2 and 4 are concerned, which was shown by sequence analysis. In total, six transcripts were identified. The additional exons have an impact on the protein structure due to the extension of the ORF coding for 51 amino acids previously to 134 now. In the longer protein the BH3 interacting domain (BID) is detected which has a known proapoptotic function. Due to the alternatively spliced exon 4 and the resulting frameshift a truncated protein exists and in its mRNA a premature stop codon is located. The proapoptotic domain is no longer detectable. In silico analyses show that the sequences of exons 1a and 1b of the PXT1 gene overlap with the KCTD20 gene which encodes for a potassium channel. In contrast to the murine testis-specific Pxt1 gene, the human homologue is also more weakly detectable in other tissues despite its predominance in testis. The number of DNA strand breaks in mice (Pxt1 knockout mouse) is examined in order to further clarify the proapoptotic function of Pxt1 in germ cells. Compared to the control animals (C57BL/6J), the Pxt1 knockout mouse shows a significantly increased number of sperm with DNA strand breaks. This result confirms the assumption that the PXT1/Pxt1 gene has the effect of a kind of disposal function to damaged sperm. However, the sperm of the knockout animals do not respond more sensitive than the wild-type animals to DNaseI, as shown in the course of time. As a possible candidate gene for mutation analysis when it comes to men with fertility problems 55 patients (azoospermia or oligozoospermia) were examined for point mutations in the PXT1 gene. A mutation was not detected. Additionally, the DNA of patients was analyzed by copy number variations. Heterozygous and homozygous duplications in exon 1 were confirmed by using the array-based Comparative Genomic Hybridization (aCGH), and also sporadically detected in exon 2 and exon3. A deletion was additionally detected in one patient. But the verified duplication in exon 1 has no clinical significance because a control group shows this duplication with a prevalence of 41% in heterozygous and 10% in homozygous form.
Keywords: PXT1; alternative splicing; DNA strand breaks; duplications; Copy Number Variations
Other Languages
Im Rahmen dieser Arbeit wurde Organisation, Expression und Funktion des humanen Peroxisomal-Testis-Spezifisch-1(PXT1)-Gens untersucht. Die mRNA des humanen PXT1-Gens enthält nicht wie bisher bekannt zwei Exons, sondern fünf Exons. Die Expression von drei putativen Exons stromaufwärts konnte in dieser Arbeit bestätigt werden. Die Ergebnisse qualitativer und quantitativer Real Time-PCR zeigen, dass sich das Exon 1 aus drei unterschiedlich gespleißten Einheiten (Exons 1a, 1b und 1c) zusammensetzt. Das humane PXT1-Gen unterliegt dem alternativen Spleißen, wovon die Exons 1b, 1c, 2 und 4 betroffen sind, was Sequenzanalysen zeigen. Sechs Transkripte konnten insgesamt identifiziert werden. Die zusätzlichen Exons haben Auswirkungen auf die Proteinstruktur aufgrund der Verlängerung des ORF, kodierend für einst 51 Aminosäuren, auf 134. Im längeren Protein wird die BH3 interacting domain (BID) nachgewiesen, von der eine proapoptotische Funktion bekannt ist. Aufgrund des alternativ gespleißten Exon 4 und der daraus resultierenden Leserasterverschiebung existiert ein verkürztes Protein, in dessen mRNA sich ein vorzeitiges Stopkodon befindet. Die proapoptotische Domäne ist nicht mehr nachweisbar. In silico-Analysen zeigen, dass die Sequenzen der Exons 1a und 1b von PXT1 sich mit dem KCTD20-Gen überlappen, das für einen Kaliumkanal kodiert.
Im Unterschied zum murinen, testisspezifischen Pxt1-Gen, ist das humane Homolog trotz Prädominanz im Testis auch schwächer in anderen Geweben nachweisbar.
Zur weiteren Klärung der proapoptotischen Funktion von Pxt1 in Keimzellen wurde am Mausmodell (Pxt1-Knockout-Maus) die Anzahl an DNA-Strangbrüchen untersucht. Im Vergleich zu den Kontrolltieren (C57BL/6J) zeigt die Pxt1-Knockout-Maus eine signifikant erhöhte Anzahl an Spermien mit DNA-Strangbrüchen. Dieses Ergebnis bestätigt die Annahme, dass das PXT1/Pxt1-Gen eine Art Entsorgungsfunktion für beschädigte Spermien ausübt. Im zeitlichen Verlauf zeigte sich aber, dass die Spermien der Knockout-Tiere nicht sensibler als die Wildtyp-Tiere auf DNaseI reagieren.
Als mögliches Kandidatengen für Mutationsanalysen bei Männern mit Fertilitätsstörungen wurden 55 Patienten mit Fertilitätsstörungen (Azoo- oder Oligozoospermie) auf Punktmutationen im PXT1 untersucht. Eine Mutation konnte nicht identifiziert werden. Des Weiteren wurde die DNA der Patienten auf Copy Number Variations analysiert. Sowohl heterozygote als auch homozygote Duplikationen konnten im Exon1, bestätigt mithilfe der arraybasierten Comparativen Genomischen Hybridisierung (aCGH), vereinzelt auch in Exon2 und Exon3 nachgewiesen werden. Zusätzlich konnte bei einem Patienten eine Deletion nachgewiesen werden. Die bestätigte Duplikation im Exon 1 besitzt aber keinen Krankheitswert, da sie in einem Kontrollkollektiv eine Prävalenz von 41% in heterozygoter und 10% in homozygoter Form besitzt.