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dc.contributor.advisor Knorr, Christoph Prof. Dr.
dc.contributor.author Strothmeyer, Marlene Sophie
dc.date.accessioned 2014-01-07T14:41:07Z
dc.date.available 2014-01-07T14:41:07Z
dc.date.issued 2014-01-07
dc.identifier.uri http://hdl.handle.net/11858/00-1735-0000-0022-5DE9-B
dc.description.abstract Bislang wurden Bullen in der Milchrinderzucht anhand des Töchterleistungsvergleiches bewertet, was zur Folge hatte, dass die Zuchtwertschätzung erst nach fünf Jahren vorlag (REENTS UND REINHARDT, 2007). Durch die 2010 eingeführte genomische Zuchtwertschätzung werden Bullenkälber bereits in den ersten Lebensmonaten geprüft und die erfolgreichen Bullen ab einem Alter von 12 Monaten zur Spermaproduktion von den Besamungsstationen eingesetzt. Zu bedenken ist dabei, dass Jungbullen unter 2 Jahren lediglich ein durchschnittliches Ejakulatvolumen von 2-4 ml aufweisen und die Spermienkonzentration deutlich unter der von Altbullen liegt. Es müssen daher entweder mehr Jungbullen zum Einsatz kommen oder die Besamungsportionen müssen in ihrer Spermienkon-zentration reduziert werden. Eine am Institut für Nutztiergenetik Mariensee ent-wickelte Methode, der Sperm-Intra-Fallopian-Transfer (SIFT®), ermöglicht es, minimal dosierte Spermaportionen unchirurgisch in den Eileiter zu übertragen (GROSSFELD ET AL., 2011B). Ein wesentlicher Vorteil dieser Methode ist die Re-duzierung des Besamungsvolumens unter Beibehaltung des Volu-men/Mengenverhältnisses. Zielsetzung dieser Arbeit war es, eine in Volumen und Spermienzahl reduzierte Spermaportion neu zu konfektionieren und ein angepasstes Kühl- sowie Gefrierprotokoll zu entwickeln. Hierbei sollten vergleichbare Auftauqualitäten wie in einer üblichen Besamungsportion erreicht werden. Die Qualität des Spermas wurde dabei sowohl unter Laborbedingungen als auch in Testbesamungen an zufällig ausgewählten Färsen und Kühen evaluiert. In ersten Screeningversuchen wurde zunächst ein Tiefgefrierverfahren für gering dosierte Verpackungssysteme (Nanostraw) mit einem Volumen bis 50 µl entwickelt. Dabei sollten vergleichbare Auftauqualitäten üblicher Besamungs-portionen erreicht werden. Es wurden sechs verschiedene Kühlkurven (A-D, D+ und E) entwickelt. Dabei zeigte sich, dass aufgrund der Stickstoff-volumeneinströme ein Haltepunkt bei -8°C in keiner der Einfrierkurven für kleine Volumina zu etablieren war. Dies ist u.a. auf die bauartbedingten Vorgaben des verwendeten Einfrierautomaten zurückzuführen. Ebenso wurde der Zusatz von 7,5% Glyzerin im Verdünner bei dem Gefrierprotokoll D+ aufgrund der Datenlage des Vorversuchs für den Hauptversuch verworfen. Die Proben wurden bullenindividuell erhoben, zur besseren statistischen Absicherung jedoch für die Auswertung zusammengefasst. Aus den Screeningversuchen erschien das Kryokonservierungsprotokoll D+ für den Nanostraw unter Laborbedingungen am geeignetsten und wurde im Thermoresistenztest, der den Bedingungen im Hinblick auf die Temperatur im Uterus bzw. Eileiter ähnlich ist, getestet. Weiterhin fand ein Vergleich der spermatologischen Qualitätsparameter nach dem Auftauen zwischen der Kontroll- und der Nanostrawgruppe mit der Kühlkurve D+ im Thermoresistenztest statt. Im praktischen Teil der Arbeit wurde die Methode SIFT® zunächst anhand eines Versuchs mit geschlechtsdifferenziertem Frischsamen praktiziert. Dabei wurden 20 Färsen mittelseiner Prid®α 1, 55g Progesteron-Spirale und zehn Kühe mit einem Ovsynch Programm synchronisiert. In einem weiteren Besamungsversuch konnte das Sperma aus den Nanostraws verwendet werden, das vorher kryokonserviert worden ist. Es wurden nur spontan brünstige Färsen und Kühe in den Eileiter besamt. Die Untersuchungen führten zu folgenden Ergebnissen: 1) In den Screeningversuchen zeigte sich, dass der Anteil motiler Spermien signifikant (p≤0,05) abhängig von der Gefriergeschwindigkeit der Kühlkurve war. Der höchste Anteil motiler Spermien aus dem Nanostraw war in Kühlkurve D+ mit einem Anteil von 52,9% zu verzeichnen. Eine signifikante Zunahme des Anteils membranintakter Spermien von Kurve A zu B und D zu D+ war zu beobachten. Die Hälfte der Nanostrawspermien zeigten in der Kühlkurve D+ eine intakte Membranintegrität. Die Kontrollspermien lagen bei 56,9%. In Kurve D+ zeigten 66,6% der Spermien aus dem Nanostraw keine morphologischen Veränderungen, in der Kontrollgruppe waren dies 75,4%. Die Änderung der Glyzerinkonzentration im Verdünnungsmedium zeigte keine signifikante Verbesserung der Spermaqualitätsparameter nach dem Auftauen. 2) Im Thermoresistenztest erreichten die Spermien aus dem Nanostraw in allen gemessenen Parametern die Mindestanforderungen an die Spermaqualität nach Rath et al. (2009). So belief sich der Anteil membranintakter Spermien aus dem Nanostraw nach dreistündiger Inkubation bei 37°C auf 56,4%, die Kontrollstrawspermien lagen bei einem Anteil von 67,2%. Dabei zeigte der Faktor Bulle einen signifikanten Effekt (p≤0,01) auf den Anteil motiler und progressiver Spermien sowie den Anteil PI-negativer Spermien. Mögliche Effekte des Bullen auf die Qualität und Befruchtungsfähigkeit der Spermien nach dem Auftauen zeigten andere Versuchsanstellungen und Forschungshypothesen (JANUSKAUSKAS ET AL., 1996, KATHIRAVAN ET AL., 2011). 3) In dem ersten Besamungsversuch wurden 20 Färsen und zehn Kühen geschlechtsdifferenziertes Sperma mit der Methode SIFT® in den Eileiter über-tragen. 37,5% der Färsen und 33% der Kühe wurden tragend. Dabei konnte ein bullenindividueller dosisabhängiger Effekt festgestellt werden. 50% der Kühe, die mit 500.000 Samenzellen inseminiert wurden und 16% der Kühe, die mit 250.000 Samenzellen besamt wurden, wurden tragend. 4) Im Besamungsversuch mit dem kryokonservierten Sperma aus dem Na-nostraw wurden sechs spontan brünstige Rinder mittels SIFT®-Spermien in den Eileiter übertragen. Alle Tiere wurden als Kälber für die Follikelpunktion in einem anderen Versuch verwendet. Fünf Tiere wurden mit dem Bullen A besamt. 40% der Tiere wurden tragend. Lediglich ein Tier wurde mit dem Bullen B besamt. Das Trächtigkeitsergebnis war negativ. Die Kühe wurden mit dem Bullen A besamt, dieser erzielte eine Trächtigkeitsrate von 33%. de
dc.language.iso deu de
dc.rights.uri http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/
dc.subject.ddc 630 de
dc.title Kryokonservierung von Bullensperma in kleinen Volumina de
dc.type doctoralThesis de
dc.title.translated Cryo-preservation of bull sperm in small volumes de
dc.contributor.referee Rath, Detlef Prof. Dr.
dc.date.examination 2013-05-16
dc.description.abstracteng To date in dairy cow breeding, bulls have been assessed by offspring perfor-mance, which resulted in estimated breeding values only after five years (REENTS AND REINHARDT, 2007). By introducing the so called genomic breeding value established in 2010, bull calves are now tested within their first months of living and successful bulls can be used for semen production at AI centres from 12 months of age on. It has to be considered that pubertal bulls only have an average ejaculate volume of 2-4ml and that the sperm concentration is much lower than in adult bulls. Therefore either more pubertal bulls need to be collected for semen or the concentration in AI portions needs to be reduced. A method established at the Institute of Farm animal Genetics in Mariensee, Germany, Sperm-Intra-Fallopian-Tube (SIFT®) enables us to transfer minimal sperm dosages non-surgically into the oviduct (GROSSFELD ET AL., 2011B). A crucial part of this method is the reduction of the insemination volume perpetuating the volume: quantity ratio. The aim of this study was to develop a new method for packaging a volume and sperm number reduced insemination portion and to establish an adapted cooling and deep freezing protocol. Comparable thawing quality to conventional insemination portions was to be gained. The sperm quality was assessed under laboratory as well as under field conditions in test inseminations with randomly assigned heifers and cows. A deep freezing procedure for low dosage confection systems (Nanostraw) with a volume of up to 50µl was established in initial screening tests. Comparable thawing qualities to conventional insemination portions should be accomplished. Six different freezing curves (A-D, D+ und E) were developed. Thereby was shown that due to the nitrogen influx into the cooling chamber, a holding point at -8°C could not be established in any of the curves. This may arise from the construction of the applied automatic freezer. Further the addition of 7.5% glycerol to the extender, using protocol D+, was dismissed in the main trial due to the data generated in the pretest. Samples were analyzed individually, but were pooled for better statistical support. From the results of the screening test the protocol D+ appeared as suitable under laboratory conditions and was tested with the thermo tolerance test, which simulates the temperature in the uterus or the oviduct, respectively. The spermatological quality parameters between the control and the Nanostraw group were analyzed after cryopreservation with the protocol D+ and thawing. For the practical part of the study, the SIFT® method was implemented with fresh sexed semen. Twenty heifers were synchronized for ovulation using a Prid®α 1,55g Progesterone spiral and ten cows using an ovsynch program, re-spectively. In a further trial the semen from cryopreserved and thawed Nanos-traws was used. Only spontaneous ovulating heifers and cows were inseminated into the fallopian tube. In summary the investigations lead to the following results: 1) The screening trials showed that the fraction of motile spermatozoa signif-icantly (p≤0.05) depended on the freezing speed of the respective protocol. The highest fraction of motile sperm (52.9%) from the Nanostraw was gained from cooling curve D+. A significant increase in membrane integrity could be seen between curve A and B as well as curve D to D+. 50% of the Nanostraw sperm showed intact membranes after freezing with curve D+. The control group fea-tured 56.9% membrane intact sperm. 66.6% of the Nanostraw sperm frozen with protocol D+ showed no morphological changes. The control group showed 75.4% morphological intact spermatozoa. The modification of the glycerol concentration in the extender showed no significant improvement of the sperm vitality parameters after thawing. 2) In the thermo tolerance test all sperm from the Nanostraw reached the minimum standards for all measured parameters defined by Rath et al (2009). Thus the fraction of membrane intact sperm added up to 56.4% for the Nanos-traw after three hours of incubation at 37°C and 67.2% for the control straw, respectively. Hereby the factor “bull” had a significant effect (p≤0.01) on motility and progressiveness as well as the number of PI negative sperm. Putative ef-fects of the bull on quality and fertility after thawing were shown in other trials and research hypotheses (JANUSKAUSKAS ET AL., 1996; KATHIRAVAN ET AL., 2011). 3) In the first insemination trial sexed semen was deposited by SIFT® method into the oviduct of 20 heifers and ten cows. 37.7% of the heifers and 33% of the cows became gravid. A bull dependent, dose response effect was identified. 50% of the cows, which were inseminated with 500,000 spermatozoa and 16% of the cows, inseminated with 250,000 spermatozoa respectively, were fertilized. 4) In the insemination trial with cryopreserved semen, six spontaneously ovulating cows were inseminated by SIFT® into the oviduct with semen from the Nanostraw. All animals had been used in trials for ovum collection by OPU technique beforehand. Five animals were inseminated with semen from bull A. Only one animal was inseminated with bull B and did not become gravid. The group of animals inseminated with bull A yielded in a pregnancy rate of 33%. de
dc.contributor.coReferee Holtz, Wolfgang Prof. Dr.
dc.subject.ger SIFT+GIFT+Bullensperma+Bullenejakulat+künstliche Besamung+Bulle+Follikel+Mariensee+Trächtigkeitsrate+Rinderzucht+Sexing+sperm sexing+ Ejakualtvolumen+Spermienkonzentration+Kryokonservierung de
dc.subject.eng cow breeding+bulls+cryo-preservation semen+semen+SIFT+GIFT+semen-intra-fallopian-transfer+oviduct+insemination+freezing+bull semen+sperm concentration+sperm volume de
dc.identifier.urn urn:nbn:de:gbv:7-11858/00-1735-0000-0022-5DE9-B-6
dc.affiliation.institute Fakultät für Agrarwissenschaften de
dc.subject.gokfull Land- und Forstwirtschaft (PPN621302791) de
dc.identifier.ppn 775761397

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