Oxidativer Stress und mitochondriale Dysfunktion in einem Mausmodell des Rett-Syndroms.
Oxidative burden in a mouse model of Rett syndrome.
by Emanuel Großer
Date of Examination:2016-08-02
Date of issue:2016-07-14
Advisor:Prof. Dr. Michael Müller
Referee:Prof. Dr. Fred Wouters
Referee:Prof. Dr. Martin Oppermann
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Name:Dissertation_Emanuel_Großer_2016.pdf
Size:5.45Mb
Format:PDF
Description:Dissertation
Abstract
English
Rett syndrome is a postnatal neurodevelopmental disorder whose major cause are mutations in the methyl-CpG-binding protein 2 (MECP2) gene. It primarily affects girls and it is associated with cognitive impairment, motor dysfunction and breathing irregularities. There is multiple evidence to suggest a direct link between an impaired mitochondrial function and the pathogenesis of Rett syndrome. Genetic analysis of the Rett genome has indicated that a subunit of the complex III is among the potentially dysregulated genes causing a proton leak across the inner mitochondrial membrane. Furthermore, blood and liquor samples of Rett patients confirmed increased oxidative damage. In this context the primary purpose of this thesis was to determine the mitochondrial function and the related redox homeostasis in a mouse model of Rett syndrome (Mecp2(-/y)). In order to quantify the intracellular redox balance the genetically-encoded optical probe roGFP1 was used to enable semiquantitative measurements of reactive oxygen species. Already under baseline conditions we detected an increased oxidative burden in Mecp2(-/y) slices. In search of the underlying cause the main intracellular scavenger enzymes superoxide dismutase, the catalase and the glutathione system were examined. All of these scavenger enzymes were unable to compensate external application of oxidative stress as efficiently as the wildtype enzymes of the peer group did. In order to modulate cytosolic redox conditions, experiments with antioxidative substances such as Ascorbate, Trolox and melatonin were carried out. These investigations proved antioxidants to be a potential pharmacotherapeutic intervention to adjust and normalise the shifted redox homeostasis in Mecp2(-/y) hippocampi. In particular, Trolox (an analog of vitamin E) appeared to be an effective scavenger and thus should be further examined in detail concerning its therapeutical potential for Rett patients. The external disturbance of mitochondrial function caused by inducing transient hypoxia as well as by the specific inhibition of several respiratory chain complexes led to a distinctly increased hypoxia susceptibility of Mecp2(-/y) hippocampi and also an increased production of reactive oxygen species. On the basis of these results it can be concluded that the several postulated impairments of redox homeostasis in Rett syndrome could be directly verified on a cellular level. The findings could provide a possible explanation regarding the diminished synaptic plasticity in Rett syndrome as the calcium concentration is partially regulated by redox-modulated ion-channels. Hence a crucial dysregulation of the disease could be identified that could lead to new pharmacotherapeutical approaches to temper the symptoms of Rett syndrome.
Keywords: Rett syndrome; MeCP2; Reactive oxygen species (ROS)
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Das Rett-Syndrom ist eine postnatale neurologische Entwicklungsstörung, der eine Mutation im Methyl-CPG-bindenden Protein 2 (MECP2) zugrunde liegt. Es betrifft überwiegend Mädchen und geht mit kognitiven Beeinträchtigungen, motorischen Stereotypien und Atmungsstörungen einher. Es existieren vielfältige Hinweise dafür, dass die Pathogenese des Rett-Syndroms im Zusammenhang mit einer beeinträchtigten Mitochondrienfunktion steht. Genetische Untersuchungen des Rett-Genoms zeigten, dass eine Untereinheit des Komplex III der Atmungskette dysreguliert ist und die innere Mitochondrienmembran ein Protonenleck aufweist. Weiterhin fanden sich Hinweise für erhöhten oxidativen Stress in Blut- und Liquoruntersuchungen. Um den intrazellulären Redox-Status zu quantifzieren, wurde die genetisch kodierte optische Sonde roGFP1 verwendet, die semiquantitative Messungen reaktiver Sauerstoffspezies ermöglichte. Es zeigte sich, dass Mecp2(-/y)-Hirnschnitte bereits unter Ruhebedingungen erhöhtem oxidativen Stress ausgesetzt sind. Auf der Suche nach der Ursache wurden die intrazellulären antioxidativen Schutzenzyme Superoxid-Dismutase und Katalase sowie das Glutathionsystem überprüft. Alle drei Enzymsysteme zeigten Funktionsstörungen und waren nicht in der Lage, extern applizierten oxidativen Stress im gleichen Umfang zu kompensieren wie die Enzyme der Wildtyp-Vergleichsgruppe. Um die zytosolischen Redox-Verhältnisse zu beeinflussen, wurden Untersuchungen mit den Antioxidantien Ascorbat, Trolox und Melatonin vorgenommen. Dabei zeigte sich, dass Antioxidantien eine potentielle pharmakologische Maßnahme darstellen, um die zu oxidativen Verhältnissen verschobene Redox-Homöostase in Mecp2(-/y)-Hippokampi zu senken und folglich zu normalisieren. Vor allem das Vitamin E-Derivat Trolox stellte sich als wirkungsvoller Radikalfänger heraus und bietet sich für weitere detaillierte Untersuchungen hinsichtlich einer therapeutischen Option des Rett-Syndroms an. Die externe Störung der mitochondrialen Funktion durch die Induktion einer transienten Hypoxie sowie die gezielte Inhibition verschiedener Atmungskettenkomplexe zeigte eine deutlich erhöhte Hypoxieempfindlichkeit der Mecp2(-/y)-Hippokampi und war mit einer erhöhten ROS-Produktion verbunden. In der Arbeit gelang es erstmals, die bereits mehrfach postulierte Störung der Redox-Homöostase im Rett-Syndrom direkt auf zellulärer Ebene nachzuweisen. Die erhobenen Befunde liefern mögliche mechanistische Erklärungsansätze für die Störung der synaptischen Plastizität im Rett-Syndrom, da es klare Verbindungen zwischen dem zellulären Redox-Status und dem Kalziumhaushalt gibt, der durch redoxsensitive Proteine mitreguliert wird. Somit konnte eine zentrale Dysregulation der Erkrankung identifziert werden, die unter Umständen auch neue pharmakologische Angriffspunkt aufzeigt, um die Symptomatik des Rett-Syndroms zu mildern.
Schlagwörter: Rett-Syndrom; MeCP2; reaktive Sauerstoffspezies (ROS)