Pore-spanning membranes – a versatile tool to analyze SNARE-mediated single vesicle fusion

by Raphael Hubrich
Doctoral thesis
Date of Examination:2018-03-29
Date of issue:2018-06-27
Advisor:Prof. Dr. Claudia Steinem
Referee:Prof. Dr. Claudia Steinem
Referee:Prof. Dr. Reinhard Jahn
Persistent Address: http://dx.doi.org/10.53846/goediss-6946

 

 

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Abstract

English

Signal transmission in neurons and hormone secretion in neuroendocrine cells such as chromaffin cells are fundamental biological processes including SNARE- (soluble N-ethylmaleimide-sensitive-factor attachment receptor) mediated membrane fusion as the key step of exocytosis. The exact mechanism of this process, and in particular how a transient rise of the intracellular Ca2+-concentration triggers or even accelerates fusion remains unclear until today. In this work, an established in vitro fusion assay based on planar pore-spanning membranes (PSMs) was employed to analyze SNARE-mediated single vesicle fusion. The investigation focused on the impact of PI(4,5)P2 and synaptotagmin-1 (syt-1) on SNARE-mediated fusion. It was found that a PI(4,5)P2 content of 2 mol% in the t-SNAREs (syx-1A, SNAP25) harboring PSM resulted in a remarkable fusion efficiency of ~92 % of the detected v-SNARE (syb 2) containing vesicles. Moreover, the co-reconstitution of the Ca2+-sensor syt-1 into the vesicular membrane aside syb 2 resulted in a significant increase in fusion kinetics in the presence of 100 µM Ca2+. This was concluded from the finding that, under equal conditions, the docking lifetime in the absence of syt-1 was determined to be twice as long (+syt-1: τ_docking^max = 22 ± 2 s vs. –syt-1: τ_docking^max = 44 ± 1 s). Aside from synthetic vesicle fusion, SNARE-mediated fusion of natural dense core vesicles, the chromaffin granules (CGs), was investigated. CGs were isolated from bovine glands to monitor and analyze single CG fusion behavior on artificial PSMs. Interestingly, CGs showed similar fusion kinetics on PSMs as observed for synthetic vesicles. This was revealed by highly comparable distributions of the docking lifetime. However, after the onset of fusion CGs exhibited a much more diverse fusion behavior in comparison to that of synthetic vesicles. Moreover, a detailed mobility analysis of SNARE-bound CGs on PSMs was performed. CGs were found to be mobile on both parts of the PSM, the free-standing (f-PSM) and the solid supported one (s PSM), with mean diffusion coefficients of 0.34 µm2/s (f-PSM) and 0.12 µm2/s (s PSM). The model system of PSMs therefore constitutes the first planar artificial membrane on which mobility of SNARE-bound CGs was monitored and analyzed. In general, a very diverse diffusion behavior of CGs on PSMs was observed, which is in good agreement with that monitored in live chromaffin cells.
Keywords: SNAREs; PSMs; Chromaffin Granules

German

Sowohl in der neuronalen Reizweiterleitung als auch bei der Sekretion von Hormonen in neuroendokrinen Zellen, wie den chromaffinen Zellen, stellt die SNARE- (soluble N-ethylmaleimide-sensitive-factor attachment receptor) vermittelte Membranfusion den Schlüsselschritt der Exocytose dar. Der exakte Ablauf dieses Prozesses und insbesondere die Art und Weise, wie eine transiente Erhöhung der intrazellulären Ca2+-Konzentration den Prozess auslöst bzw. beschleunigt, konnte bis heute nicht endgültig aufgeklärt werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein auf dem Modellsystem der porenüberspannenden Membran (PSM) basierender in vitro Fusionsassay zur Detektion und Analyse SNARE-vermittelter Einzelfusions-ereignisse von Proteoliposomen eingesetzt. Der Fokus lag hierbei auf der Untersuchung des Einflusses von PI(4,5)P2 und Synaptotagmin-1 (syt-1) auf die SNARE-vermittelte Membranfusion. Es konnte gezeigt werden, dass ein Anteil von 2 mol% des polyanionischen Phospholipids PI(4,5)P2 in der PSM zu einer sehr hohen Fusionseffizienz von ~92 % führte. Darüber hinaus konnte in Anwesenheit des Ca2+ Sensors syt-1 in der Membran der Proteoliposomen bei einer eingestellten Ca2+-Konzentration von 100 µM eine signifikante Steigerung der Fusionskinetik registriert werden. Diese Erkenntnis spiegelt die Tatsache wider, dass die beobachtete mittlere Lebensdauer eines gedockten Proteoliposoms vor dem Einsetzen der Fusion in der Gegenwart von syt-1 nur halb so lang war wie in dessen Abwesenheit (+syt 1: τ_docking^max = 22 ± 2 s vs. –syt-1: τ_docking^max = 44 ± 1 s). Neben dem Fusionsverhalten synthetischer Proteoliposomen wurde auch das von natürlichen sekretorischen Vesikeln, den chromaffinen Granula (CGs) analysiert. Diese wurden hierzu aus Rindernebennieren isoliert und ihr Einzelfusionsverhalten auf PSM untersucht. Interessanterweise zeigten diese natürlichen Vesikel eine vergleichbare Fusionskinetik wie synthetische Proteoliposomen, was aus der sehr ähnlichen Verteilung der ermittelten Lebensdauer des gedockten Zustandes gefolgert wurde. Nach dem Einsetzen der Fusion jedoch, angezeigt durch Lipidvermischung zwischen Vesikelmembran und PSM, offenbarten die CGs ein deutlich vielfältigeres Fusionsverhalten als die synthetischen Proteoliposomen. Des Weiteren wurde die Mobilität SNARE-gebundener CGs auf PSMs genauer untersucht. CG Diffusion wurde hierbei auf beiden Bereichen der PSM, dem festkörperunterstützten (s PSM) sowie dem freitragenden (f-PSM) Bereich detektiert und mittlere Diffusionskoeffizienten von 0.12 µm2/s (s PSM) und 0.34 µm2/s (f-PSM) ermittelt. Das Modellsystem der PSM stellt somit die erste planare, artifizielle Membran dar, auf der CG Mobilität beobachtet und analysiert werden konnte. Insgesamt wurde ein sehr vielfältiges Diffusionsverhalten der CGs auf PSMs beobachtet, welches sehr gut mit jenem übereinstimmt, das in lebenden chromaffinen Zellen detektiert wurde.
 
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