Funktionale Analyse des CC-Typ Glutaredoxin ROXY19 in Arabidopsis thaliana

Functional Analysis of CC-type glutaredoxin ROXY19 in Arabidopsis thaliana

by Jan Oberdiek
Doctoral thesis
Date of Examination:2018-05-31
Date of issue:2019-02-05
Advisor:Prof. Dr. Christiane Gatz
Referee:Prof. Dr. Jörg Stülke
Referee:Dr. Corinna Thurow
Persistent Address: http://dx.doi.org/10.53846/goediss-7267

 

 

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Abstract

English

Glutaredoxins are small widespread enzymes that are characterized by the so-called thioredoxin fold. They have an active center which can be reduced by glutathione. The glutaredoxins are divided into three classes according to their active center: class I CPYC-type, class II CGFS-type and class III CC-type (called ROXYs in Arabidopsis thaliana). For class I and II the biochemical properties as oxidoreductases and scaffold proteins for iron-sulfur clusters are described. They contribute to the redox homeostasis of the cell, the regulation of signalling processes, and DNA synthesis. The CC-type class is specific to higher land plants. It has been found to be involved in developmental processes and pathogen defense responses. ROXYs interact physically and genetically with TGA transcription factors. Ectopically expressed ROXY19 suppressed class II TGA-mediated (TGA2, TGA5 and TGA6) expression of ethylene/jasmonic acid-induced defense genes and detoxification genes. The aim of this work was to investigate a possible mechanism for this repression. Possibilities are an enzymatic activity of ROXY19, which allows a redox modification of cysteine residues, or the incorporation of an iron-sulfur cluster as a possible regulatory mechanism. To investigate these glutaredoxin-specific functions, recombinantly expressed ROXY19 from Escherichia coli was used. The affinity to glutathione was detected for ROXY19 with the help of MicroScale Thermophoresis. The affinity was dependent on the CCMC motif and similar to a CPYC type glutaredoxin (GRX370) which had enzymatic activity in the 2-hydroxyethyl disulfide assay. However, ROXY19 had no activity in the 2-hydroxyethyl disulfide assay. A mutation of the active site to the CPYC motif was not sufficient to ensure activity in the 2-hydroxyethyl disulfide assay. The iron-sulfur cluster analysis showed that ROXY19 was able to incorporate an iron species of an unknown type. Further analysis showed that recombinantly expressed ROXY19 from Escherichia coli formed higher molecular oligomers. Reconstitution experiments to determine the type of iron-sulfur cluster with the oligomer and monomer were unsuccessful. Based on Electrophoretic Mobility Shift Assay analysis, a possible mechanism of ROXY19 to control TGA2 activity was discovered. ROXY19 showed a positive influence on TGA2 binding on a radioactive labeled activating sequence-1 promoter fragment (including the TGA binding sequence 5'-TGACG'-3). This feature was independent of the active site and was also observed for the CPYC type glutaredoxin GRX370. ROXY19 induced an additional change in the mobility of the TGA2-activating sequence-1 complex in gel electrophoresis. These data support a ROXY19-TGA2 complex bound to the DNA. The complex might be a possibility to recruit TOPLESS to promoter regions of class II TGA-controlled genes. Huang et al. (2016) observed that plants ectopically expressing ROXY19 in Col-0 background show reduced growth on the xenobiotic 2,3,5-triiodobenzoic acid compared to Col-0 plants. This was based on the ROXY19-mediated repression of detoxification genes. The repression is dependent on the CCMC motif of ROXY19, a mutation to SSMS showed wild-type-like growth. In this work it was shown in planta that the 2,3,5-triiodobenzoic acid susceptible phenotype of plants expressing ROXY19 (Huang et al., 2016) was depending on the first but not the second cysteine of the CCMC motif. Furthermore it was shown, that iron availability had no influence on the ROXY19-mediated repression of class II TGA transcription factor target genes.
Keywords: Arabidopsis thaliana; ROXY19; Glutaredoxin; Redox biology plants

German

Glutaredoxine sind kleine weit verbreitete Enzyme, die durch die sogenannte Thioredoxin Faltung charakterisiert sind und ein aktives Zentrum besitzen, welches durch Glutathion reduziert werden kann. Die Glutaredoxine werden anhand ihres aktiven Zentrums in drei Klassen eingeteilt: Klasse I CPYC-Typ, Klasse II CGFS-Typ und Klasse III CC-Typ (in Arabidopsis thaliana auch ROXYs genannt). Ihre biochemischen Eigenschaften als Oxidoreduktasen und Gerüstproteine für Eisen-Schwefel-Cluster sind für die CPYC und CGFS Klasse in der Literatur beschrieben. Ihre Funktionen liegen in der Redox-Homöostase der Zelle, der Regulation von Signalprozessen und der DNA-Synthese. Die CC-Typ Klasse ist spezifisch für Landpflanzen. Für Mitglieder dieser Klasse wurde gezeigt, dass sie an Entwicklungs- und Pathogenabwehrprozessen beteiligt sind. ROXYs interagieren physikalisch und genetisch mit TGA Transkriptionsfaktoren. Ektopisch exprimiertes ROXY19 unterdrückt die Klasse II TGA-vermittelte (TGA2, TGA5 und TGA6) Expression von Ethylen/Jasmonsäure-induzierten Abwehrgenen und der Expression von Klasse II TGA-abhängigen Detoxifikationsgenen. Das Ziel dieser Arbeit war es den Mechanismus dieser ROXY19-vermittelten Repressionen zu untersuchen. Mögliche Mechanismen wären eine enzymatische Aktivität von ROXY19, die eine Redoxmodifikation von Cysteinresten erlauben würde oder die Inkorporation eines Eisen-Schwefel-Clusters als Regulationsmechanismus. Um diese Glutaredoxin-spezifischen Funktionen zu untersuchen, wurde rekombinant exprimiertes ROXY19 aus Escherichia coli verwendet. Mithilfe der MicroScale Thermophorese konnte eine Glutathion-Bindung, die abhängig vom CCMC Motiv war, nachgewiesen werden. Die Affinität von ROXY19 zum Glutathion war vergleichbar mit der eines CPYC-Typ Glutaredoxin (GRX370), welches enzymatische Aktivität im 2-Hydroxyethyldisulfid-Assay besaß. ROXY19 hingegen besaß keine Aktivität im 2-Hydroxyethyldisulfid-Assay. Eine Mutation des aktiven Zentrums von ROXY19 zum CPYC Motiv war nicht ausreichend, um eine Aktivität im 2-Hydroxyethyldisulfid-Assay zu beobachten. Die Eisen-Schwefel-Cluster Analysen ergaben, dass ROXY19 eine Eisen-Spezies unbekannten Typs inkorporieren konnte. Weitere Analysen zeigten, dass rekombinant exprimiertes ROXY19 aus Escherichia coli als Oligomer vorlag. Rekonstitutionsversuche zur Bestimmung des putativen Eisen-Schwefel-Clusters mit dem Oligomer und Monomer waren nicht erfolgreich. Aufgrund von „Electrophoretic Mobility Shift Assay“-Analysen konnte ein möglicher Mechanismus der Regulation von TGA2 gefunden werden. ROXY19 zeigte einen positiven Einfluss auf die Bindeeigenschaften von TGA2 an ein radioaktiv markiertes activating sequence-1 Promotor Fragment (beinhaltet die TGA Bindesequenz 5’-TGACG‘-3). Diese Eigenschaft war jedoch unabhängig vom aktiven Zentrum und konnte ebenfalls bei dem CPYC-Typ Glutaredoxin GRX370 beobachtet werden. ROXY19 konnte eine zusätzliche Veränderung der Mobilität des TGA2-activating sequence-1 Komplexes in der Gelelektrophorese hervorrufen. Diese Daten sprechen für einen ROXY19-TGA2 Komplex an der DNA. Dieser Komplex könnte die Möglichkeit bieten TOPLESS an Promotor Regionen von Klasse II TGA-kontrollierten Genen zu rekrutieren. Huang et al. (2016) zeigten, dass Pflanzen die im Col-0 Hintergrund ROXY19 ektopisch exprimieren schlechter auf Medium mit dem Xenobiotikum 2,3,5-Triiodobenzoesäure als Col-0 Pflanzen wachsen. Dies konnte auf eine ROXY19-vermittelte Repression von Genen die an der Entgiftung beteiligt sind zurückgeführt werden. Die Repression ist abhängig vom CCMC Motiv des ROXY19, eine Mutation zum SSMS zeigte Wildtyp Wachstum. In dieser Arbeit konnte in planta gezeigt werden, dass der durch das 2,3,5-Triiodobenzoesäure verursachte Wachstumsphänotyp von Pflanzen, die ROXY19 ektopisch exprimierten (Huang et al., 2016), vom ersten Cystein des CCMC Motivs, aber nicht vom zweiten, abhängig war. Desweiteren konnte gezeigt werden, dass die Eisenverfügbarkeit keinen Einfluss auf die ROXY19-vermittelte Repression von Zielgenen der Klasse II TGA Transkriptionsfaktoren hatte.
 
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