Identification of factors involved in cell wall homeostasis and tolerance towards quaternary ammonium compounds in Listeria monocytogenes by genomic adaptation

by Lisa Maria Schulz
Doctoral thesis
Date of Examination:2023-05-11
Date of issue:2023-06-20
Advisor:Dr. Jeanine Rismondo
Referee:Prof. Dr. Rolf Daniel
Referee:Prof. Dr. Carsten Lüder
Referee:Prof. Dr. Gerhard Braus
Referee:PD Dr. Michael Hoppert
Referee:Prof. Dr. Stefan Pöhlmann
Persistent Address: http://dx.doi.org/10.53846/goediss-9942

 

 

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Abstract

English

Listeria monocytogenes is one of the most successful food-borne pathogens worldwide. Despite available treatment with cell wall targeting antibiotics an infection with concomitant development of listeriosis results in death in approximately 13% of the cases. Hence, the cell wall has been subject to extensive studies due to its potential as a target for novel drugs. Nevertheless, various involved factors are still uncharacterized, and how the associated pathways are interconnected and communicate with each other remains elusive. L. monocytogenes outbreaks are often associated with strains that are tolerant towards quaternary ammonium compounds (QAC), the active agent in disinfectants, which is commonly applied to prevent contamination. The underlying genomics of QAC adaptation are poorly understood and studies often solely focus on tolerance towards benzalkonium chloride (BAC). In our study we employed an intensive in-depth suppressor screen to A) investigate the potential role of the putative ABC transporter EslABC in cell wall biosynthesis, lysozyme resistance and cell division and B) identify mechanisms that confer tolerance towards the two QACs BAC and cetyltrimethylammonium bromide (CTAB). The identification of mutations in a strain lacking the transmembrane protein EslB revealed an involvement of the transporter in several processes associated with cell wall homeostasis. Phenotypic defects of the ΔeslB strain, such as sensitivity towards lysozyme or a cell division defect, could be rescued via different mechanisms, including increased production of peptidoglycan (PG) biosynthesis as well as reduced PG hydrolysis. We hypothesised that the phenotypes are a consequence of a combination of several disrupted processes associated with cell wall homeostasis that potentially result from altered levels or availability of UDP-GlcNAc. This is demonstrated by reduced PG levels established in a thinner cell wall, as well as an overall more negative surface charge that enables increased binding and activity of cationic compounds such as lysozyme and hydrolases. Altogether EslB is a prime example which demonstrates that the loss of a single factor can have implementations on various crucial processes, highlighting the intricate nature of communication and harmonization of cell wall associated pathways. The second part of the thesis revealed that the EGD-e wildtype strain readily adapts to BAC and CTAB stress predominantly via mutations that result in overexpression of the efflux systems FepA and SugE1/2, respectively. FepA seems to have a higher affinity for BAC, while SugE1/2 is the main system for CTAB tolerance. Interestingly, fepA associated mutations additionally conferred resistance towards gentamycin and ciprofloxacin, raising the question if it is more beneficial to use CTAB as the active agent in disinfectants to avoid cross-adaptation. Altogether, this study revealed the underlying mechanisms responsible for CTAB and BAC adaptation in L. monocytogenes.
Keywords: Listeria monocytogenes; transporter; cell wall; lysozyme resistance; antibiotic resistance; quaternary ammonium compounds; EslABC

German

Die manifeste Listeriose, die durch das Human Pathogen Listeria monocytogenes ausgelöst wird, führt trotz Behandlung mit Zellwandantibiotika in ca. 13% der Fälle zum Tod. Bei der Entwicklung neuartiger Medikamente steht die bakterielle Zellwand als potenzieller Angriffspunkt im Fokus. Trotz zahlreicher Studien gibt es jedoch immer noch etliche unbestimmte Faktoren und viele offene Fragen in Bezug auf das Zusammenspiel und die Abhängigkeit der verschiedenen Prozesse, die zum Aufbau der Zellwand beitragen. Zur Bekämpfung von Kontamination wird häufig auf die Verwendung von Desinfektionsmittel, die quaternäre Ammoniumverbindungen (QACs) als antimikrobiellen Wirkstoff beinhalten, zurückgegriffen. Daher stehen Ausbrüche häufig in Verbindung mit Stämmen, die eine erhöhte transiente Toleranz gegenüber QACs aufweisen. Die genomischen Variationen, die für die QAC-Adaption verantwortlich sind, werden allerdings oft nur am Rande behandelt. Mit dieser Arbeit wird das Ziel verfolgt, zum einen die Rolle des putativen ABC-Transporters EslABC im Kontext der Zellwandbiosynthese, der Zellteilung und der Sensitivität gegenüber Lysozym zu beleuchten und zum anderen die zugrundeliegenden genomischen Mechanismen zu identifizieren, die für die Toleranz gegenüber den beiden QACs BAC und Cetyltrimethylammoniumbromid (CTAB) verantwortlich sind. Suppressor Mutationen, die in einem Stamm identifiziert wurden, der das Transmembranprotein EslB des Transporters nicht mehr aufweist, legen die Beteiligung des Transporters in der Zellwandhomöostase nahe. Die phänotypischen Defekte der ΔeslB Mutante, wie zum Beispiel eine erhöhte Sensitivität zu Lysozym oder ein Zellteilungsdefekt, konnten unter anderem durch reduzierte Aktivität von Zellwand Hydrolasen, oder durch erhöhte Peptidoglycan (PG) Biosynthese aufgehoben werden. Wir vermuten, dass die Phänotypen ein Resultat aus der Kombination von verschiedenen gestörten Prozessen sind, die an der Erhaltung der Zellwandhomöostase beteiligt sind. Veränderte UDP-GlcNAc Mengen, oder Verfügbarkeit, die sich durch reduzierte PG Mengen, einer damit verbundenen dünneren Zellwand, so wie eine erhöhte negative Zellladung, widerspiegelt, spielen dabei vermutlich eine ausschlaggebende Rolle. Am Beispiel von EslB wird hervorgehoben, dass der Verlust eines einzelnen Faktors Auswirkungen auf diverse grundlegende Prozesse haben kann. Diese verdeutlichen die Komplexität der Abhängigkeit, Kommunikation und Balance zwischen verschiedenen Prozessen, die einer reibungslosen Zellwandarchitektur zu Grunde liegen. In dem zweiten Teil der Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Überproduktion von den Effluxpumpen FepA und SugE1/2, die durch Mutationen hervorgerufen wurden zur Toleranz gegenüber BAC und CTAB führen. Dabei legen die Daten nahe, dass FepA eine größere Rolle für die BAC-Toleranz spielt, während SugE1/2 wichtiger für CTAB-Anpassung sind. Da Mutationen im fepA Gen zusätzliche zur Resistenz gegenüber Ciprofloxacin und Gentamycin führten, ist es vermutlich ratsamer in Desinfektionsmitteln eher auf CTAB als Wirkstoff zurückzugreifen.
 
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