Identification and characterization of plant lipid droplet-associated proteins

by Philipp William Niemeyer
Cumulative thesis
Date of Examination:2023-06-29
Date of issue:2024-02-23
Advisor:Prof. Dr. Till Ischebeck
Referee:Prof. Dr. Till Ischebeck
Referee:Prof. Dr. Andrea Polle
Persistent Address: http://dx.doi.org/10.53846/goediss-10373

 

 

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Abstract

English

The molecular study of plant lipid droplets, first described over a century ago, has garnered attention since the identification of oleosins in the 1980s’. In recent years, considerable progress has been achieved in identifying and characterizing plant lipid droplet proteome constituents. However, most of our understanding originates from investigations conducted on oil seeds, seedlings, mesocarp, pollen, and leaves, with a disproportionate focus on angiosperms. Lipid droplets are present across all domains of life, although the proteins and their composition identified thus far exhibit significant diversity, even within the same species’ tissues. Therefore, a high degree of specialization and functional versatility can be expected. Indeed, lipid droplets have been associated with numerous biological processes, encompassing lipid metabolism and remodeling, energy storage, signaling, and the production of defense compounds. They may also enhance resilience to abiotic stress. Lately, lipid droplets and a subset of their proteins have been proposed to be a remnant of an ancient desiccation tolerance mechanism that persists in angiosperm seeds and pollen. The advantage obtained by early land plants through this mechanism may have been pivotal for the great success of plant terrestrialization. In this thesis, we applied a bottom-up label-free proteomic approach on desiccation tolerant and oil-rich tubers of yellow nutsedge and compared it against the same species’ leaves and roots, as well as desiccation sensitive and oil-depleted tubers of the closest related species, purple nutsedge. The acquired data unveiled a proteomic fingerprint consisting of antioxidants, heat shock proteins, and late embryogenesis abundant proteins resembling desiccation-tolerant seeds’ composition. Furthermore, our findings strongly indicate that seed-type lipid droplet proteins oleosins, caleosins, steroleosins, and a seed lipid droplet protein play central roles in the seed-like desiccation tolerance program. The putative co-option of those features in tubers may be achieved through transcription factors ABSCISIC ACID INSENSITIVE3, WRINKLED1, and LEAFY COTYLEDON1 regulation. Applying a similar approach to germinating spores of Physcomitrium patens and comparing them to vegetative gametophytes, most of these desiccation tolerance-mediating traits reappear, further supporting the hypothesis that they existed prior to the emergence of seeds. It further sheds light on the LD proteome composition of a bryophyte spore. In another proteomic study, we described lipid droplet protein composition for the first time in the subterranean tissue of Arabidopsis thaliana roots. As a result, we were able to identify 12 novel proteins localized to the lipid droplets, in addition to 31 previously described. Their assigned functions indicate diverse metabolic roles, involvement in developmental processes, and responses to stress, which highlights the nature of lipid droplets as active organelles in vegetative tissues. Protein characterization is a time-consuming process, and for several identified LD proteins, characterization has not yet been conducted. To initially characterize the lipid dropletassociated methyltransferase (LIME) protein family, a range of techniques was employed, including in silico phylogeny, cell biological approaches, phenotype evaluation, and biochemical analyses. This approach provided initial insights into a highly conserved protein family with an unique and complex lipid droplet targeting mechanism. It is putatively the evolutionary origin of complex alkaloid-producing methyltransferases found in opium poppy and other species, but likely has a distinct function. Overall, this work identifies new plant lipid droplet proteins and contributes to our understanding of the roles of these in desiccation tolerance. It further gives first insights into the LIME protein family. Therefore, it will serve as a foundation for further research.
Keywords: lipid droplets; Arabidopsis thaliana; Physcomitrium patens; proteomics; Cyperus esculentus; lipid droplet-associated methyltransferase; spores; desiccation tolerance; tubers

German

Die molekulare Untersuchung von pflanzlichen Lipidtröpfchen, die vor über einem Jahrhundert erstmals beschrieben wurde, hat seit der Identifizierung von Oleosinen in den 1980er Jahren Aufmerksamkeit erregt. In den letzten Jahren wurden erhebliche Fortschritte bei der Identifizierung und Charakterisierung der Proteombestandteile von pflanzlichen Lipidtröpfchen erzielt. Die meisten Erkenntnisse stammen jedoch aus Untersuchungen an Ölsamen, Keimlingen, Mesokarp, Pollen und Blättern, wobei ein unverhältnismäßiger Fokus auf Angiospermen liegt. Lipidtröpfchen sind in allen Lebensbereichen vorhanden, obwohl die bisher identifizierten Proteine und ihre Zusammensetzung selbst innerhalb derselben Gewebespezies erhebliche Vielfalt aufweisen. Daher kann eine hohe Spezialisierung und funktionale Vielseitigkeit erwartet werden. Tatsächlich wurden Lipidtröpfchen mit zahlreichen biologischen Prozessen in Verbindung gebracht, darunter Lipidstoffwechsel und -austausch, Energiespeicherung, Signalgebung und die Produktion von Abwehrstoffen. Sie können auch die Widerstandsfähigkeit gegen abiotischen Stress erhöhen. In letzter Zeit wurde erörtert, dass Lipidtröpfchen und eine Untergruppe ihrer Proteine ein Überbleibsel eines alten Mechanismus der Austrocknungstoleranz seien, der in Samen und Pollen von Angiospermen fortbesteht. Der durch diesen Mechanismus erlangte Vorteil könnte für den großen Erfolg der terrestrischen Pflanzung von entscheidender Bedeutung gewesen sein. In dieser Arbeit haben wir einen bottom-up, label-free proteomischen Ansatz auf austrocknungstoleranten und ölreichen Knollen von Erdmandeln angewendet und ihn mit den Blättern und Wurzeln derselben Spezies sowie mit austrocknungssensiblen und ölarmen Knollen der engsten verwandten Spezies, das Knollige Zypergras, verglichen. Die gewonnenen Daten enthüllten einen proteomischen Fingerabdruck, der aus Antioxidantien, Hitzeschockproteinen und late-embryogenesis-abundant-Proteinen besteht, was der Zusammensetzung von austrocknungstoleranten Samen ähnelt. Darüber hinaus deuten unsere Ergebnisse stark darauf hin, dass Proteine von Lipidtröpfchen wie Oleosine, Caleosine, Steroleosine und ein seed-lipid-droplet-Protein zentrale Rollen im austrocknungstoleranten Programm spielen. Die vermutliche Übernahme dieser Merkmale in Knollen könnte durch die Regulation von Transkriptionsfaktoren wie ABSCISIC ACID INSENSITIVE3, WRINKLED1 und LEAFY COTYLEDON1 erreicht werden. Durch die Anwendung eines ähnlichen Ansatzes auf keimende Sporen von Physcomitrium patens und den Vergleich mit vegetativen Gametophyten erscheinen die meisten dieser Merkmale zur Austrocknungstoleranz erneut, was die Hypothese weiter unterstützt, dass sie bereits vor dem Auftreten von Samen existierten. Dies bringt weitere Klarheit über die Proteomzusammensetzung von Lipidtröpfchen einer Bryophyten-Spore. In einer anderen proteomischen Studie haben wir erstmals die Proteinzusammensetzung von Lipidtröpfchen im unterirdischen Gewebe der Wurzeln von Arabidopsis thaliana beschrieben. Dadurch konnten wir 12 neue Lipidtröpfchenlokalisierende Proteine identifizieren, zusätzlich zu den zuvor beschriebenen 31. Ihre zugewiesenen Funktionen deuten auf vielfältige metabolische Aufgaben, Beteiligung an Entwicklungsprozessen und Reaktionen auf Stress hin, was die Natur von Lipidtröpfchen als aktive Organellen in vegetativen Geweben betont. Die Charakterisierung von Proteinen ist ein zeitaufwändiger Prozess, und für mehrere identifizierte Lipidtröpfchenproteine wurde die Charakterisierung noch nicht durchgeführt. Um die lipid droplet-associated methyltransferase (LIME) Protein-Familie vorläufig zu charakterisieren, wurden verschiedene Techniken eingesetzt, darunter in silico Phylogenie, zellbiologische Ansätze, Phänotypbewertung und biochemische Analysen. Dieser Ansatz lieferte erste Einblicke in eine hoch konservierte Protein-Familie mit einem einzigartigen und komplexen Lipidtröpfchen-Targeting-Mechanismus. Es handelt sich möglicherweise um den evolutionären Ursprung von komplexen Alkaloid-produzierenden Methyltransferasen, die in Schlafmohn und anderen Arten gefunden wurden, aber wahrscheinlich eine unterschiedliche Funktion haben. Insgesamt identifiziert diese Arbeit neue Proteine von pflanzlichen Lipidtröpfchen und trägt zu unserem Verständnis ihrer Rolle bei der Austrocknungstoleranz bei. Sie gibt außerdem erste Einblicke in die LIME-Proteinfamilie. Daher wird sie als Grundlage für weitere Forschungen dienen.
 
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