Pathogen-induced cell wall remodeling and production of Danger Associated Molecular Patterns (DAMPs)

by Sina Barghahn
Doctoral thesis
Date of Examination:2020-03-26
Date of issue:2020-08-25
Advisor:Prof. Dr. Volker Lipka
Referee:Prof. Dr. Volker Lipka
Referee:Dr. Till Ischebeck
Referee:Prof. Dr. Harry Brumer
Persistent Address: http://dx.doi.org/10.53846/goediss-8172

 

 

Files in this item

Name:Dissertation_Sina Barghahn.pdf
Size:9.39Mb
Format:PDF

The following license files are associated with this item:

Abstract

English

For a plant pathogen, overcoming the plant cell wall is crucial for a successful infection. Thus, pathogens evolved different strategies to invade their host plants. These include entry through natural openings such as stomata and wounds or direct penetration of plant cell walls with specialised invasion structures that generate high pressure as well as cell wall degrading enzymes (CWDEs). CWDEs can be classified into different groups according to their potential function and include e.g. Glycoside Hydrolases (GHs), which are implicated in the hydrolysis of glycosidic linkages in complex carbohydrates such as the plant cell wall component cellulose. GHs have been shown to be involved in pathogenicity of hemibiotrophic and necrotophic plant-pathogenic fungi. However, the role of GHs in biotrophic plant-pathogenic fungi has not been elucidated so far. The first part of the present study focused on the identification and functional characterization of GH17 family members of the powdery mildew Blumeria graminis f.sp. hordei (Bgh) that may contribute to pathogenicity due to a transcriptional induction during infection of immunocompromised Arabidopsis plants. Of these, Bgh GH17 protein BGH06777 was successfully expressed in the heterologous system P. pastoris, purified and functionally characterized. The glycosylated enzyme showed optimal activity at pH 5.5 in a temperature range from 25°C - 51°C and hydrolysed β 1,3 glucans with a minimum length of four glucose residues. The catalytic efficiencies for hydrolysis of the β 1,3 glucan hexamer and pentamer were 1.858 mM-1 s-1 and 0.3836 mM-1 s-1, respectively. 18O labelling of the products revealed that the enzyme contains at least six substrate binding sites comprised of four negative and two positive subsites. In conclusion, the detailed biochemical characterization conducted in this study suggests that BGH06777 might degrade β-1,3-glucans present in plant papillae, however, the exact function and localization of this protein remains to be shown. Plants are able to perceive potential pathogens through the recognition of conserved non-self microbial structures, so-called pathogen or microbe-associated molecular patterns (PAMPs/MAMPs), at the plant surface via pattern recognition receptors (PRRs). Furthermore, plants can detect self molecules that are only abundant upon cell damage or wounding, which are called damage or danger-associated molecular patterns (DAMPs). Both, MAMP or DAMP recognition triggers a signaling cascade that leads to the induction of defence responses. It is conceivable to postulate that the activity of CWDEs results in the release of cell-wall derived oligosaccharides with DAMP capacity. Thus, the second part of this study aimed at identifying novel cell-wall derived DAMPs and molecular components of the corresponding plant perception and signaling machinery. As a major result of this work, mixed linkage glucan (MLG) oligosaccharides were shown to trigger immune responses in the dicot model plant Arabidopsis and the monocot barley. The MLG-induced responses were similar to plant responses to the well-characterized MAMPs and DAMPs chitin, flg22 and OGs. In contrast to other MAMPs and DAMPs, MLG oligosaccharides did not elicit a detectable generation of reactive oxygen species or affect seedling growth in Arabidopsis. MLGs are abundant cell wall components of monocot grasses, e.g. barley, and the plant pathogenic fungus Rhynchosporium commune (formerly R. secalis) but are absent in the dicot model plant Arabidopsis. Thus, MLG oligosaccharides might function in a plant-species specific manner as MAMP or DAMP (or both). A reverse genetic screen conducted with a collection of known DAMP/MAMP receptor and co-receptor mutants revealed that MLG perception and downstream signaling is likely to involve so far unknown molecular components.
Keywords: cell wall degrading enzymes; glycoside hydrolase; plant immunity; MAMP

German

Für ein Pflanzenpathogen ist das Überwinden der Zellwand entscheidend für eine erfolgreiche Infektion. Daher haben Pflanzenpathogene verschiedene Strategien entwickelt, um in Pflanzen einzudringen. Diese Strategien schließen das Eindringen über natürlich vorkommende Öffnungen wie Stomata oder Verwundungen, direkte Penetration mit spezialisierten Strukturen, die einen hohen Druck erzeugen, sowie Zellwand hydrolysierende Enzyme (CWDEs) ein. Abhängig von ihrer potentiellen Funktion, können CWDEs in verschiedene Gruppen klassifiziert werden. Unter Anderem gibt es die Klasse der Glycosyl Hydrolasen (GHs), die glykosidische Bindungen in komplexen Karbohydraten spalten wie zum Beispiel Zellulose, einem Bestandteil der pflanzlichen Zellwand. Es wurde gezeigt, dass GHs wichtig für die Pathogenität von hemibiotrophen und necrotrophen Pflanzenpathogenen sind. Die Rolle von GHs in biotrophen Pflanzenpathogenen wurde hingegen noch nicht geklärt. Der erste Teil dieser Arbeit konzentrierte sich auf die Identifizierung und Charakterisierung der Mitglieder der GH17 Familie des Mehltau Pilzes Blumeria graminis f.sp. hordei (Bgh). Diese Familie spielt möglicherweise eine Rolle in der Pathogenität, da die Transkription dieser Familie während der Infektion von immunsupprimierten Arabidopsis Pflanzen induziert ist. Das Bgh Protein BGH06777 konnte erfolgreich in dem heterologen Expressionssystem P. pastoris exprimiert und schließlich aufgereinigt und funktional charakterisiert werden. Das glykolisierte Protein zeigte die optimale Aktivität bei einem pH Wert von 5.5 in einem Temperaturbereich von 25°C bis 51°C und hydrolisierte β-1,3-glukane mit einer minimalen Länge von vier Glukosemolekülen. Die katalytischen Effizienzen für die Hydrolyse des β-1,3-glukan Hexamers und β-1,3-Glukan Pentamers lagen bei jeweils 1.858 mM 1 s-1 und 0.3836 mM 1 s-1. Die Markierung der Hydrolyseprodukte mit 18O ergab, dass das Enzym mindestens sechs Bindestellen für das Substrat hat bestehend aus vier negativen und zwei positiven Bindestellen. Die detallierte biochemische Analysis deutet an, dass BGH06777 β 1,3 glukane, die in pflanzlichen Papillen zu finden sind, hydrolysieren könnte. Die exakte Funktion sowie die Lokalisierung dieses Enzyms müssen jedoch noch gezeigt werden. Pflanzen können potentielle Pathogene durch das Erkennen von konservierten mikrobiellen Struktuen, sogenannten Pathogen- oder Mikroben-assoziierten molekularen Mustern (PAMPs/MAMPs), an der Oberfläche durch membranständige Rezeptoren wahrnehmen. Weiterhin können Pflanzen auch Moleküle wahrnehmen, die von der Pflanze selbst stammen, aber nur nach Verwundung oder Beschädigung der Zelle vorhanden sind. Diese Moleküle werden Schaden- oder Gefahr-assoziierte molekulare Muster (DAMPs) genannt. Sowohl MAMPs als auch DAMPs aktivieren eine Signalkaskade, die zur Induktion der Immunantwort führt. Es ist vorstellbar, dass Zellwandfragmente mit DAMP Kapazität durch die Aktivität von CWDEs entstehen. Der zweite Teil der Arbeit fokussiert sich daher auf die Identifizierung von neuen DAMP Molekülen, die von der Zellwand stammen, sowie den jeweiligen molekularen Komponenten, die an der Perzeption und der Signaltransduktion beteiligt sind. Eines der wichtigsten Ergebnisse dieser Arbeit ist, dass β 1,3;1,4-glukan Oligosaccharide Immunantworten in der dikotylen Pflanze Arabidopsis und der monokotylen Nutzpflanze Gerste auslösen. Diese Immunantworten ähneln den pflanzlichen Abwehrantworten, die durch die gut charakterisierten MAMPs und DAMPs Chitin, Flagellin und Oligogalakturonide ausgelöst werden. Im Gegensatz zu anderen MAMPs und DAMPs aktivieren die Oligosaccharide jedoch nicht die Generierung von reaktiven Sauerstoffspezies und beeinflussen auch nicht das Wachstum von Arabidopsis Setzlingen. Das β-1,3;1,4-glukan Polymer ist ein Bestandteil der Zellwand von monokotylen Gräsern, wie zum Beispiel Gerste, und dem Pflanzenpathogen Rhynchosporium commune (ehemals bekannt als R. secalis), aber ist kein Zellwandkomponent der dikotylen Modellpflanze Arabidopsis. Dies legt den Schluss nahe, dass β-1,3;1,4-glucan Oligosaccharide in einer Pflanzenart-spezifischen Weise als MAMP oder DAMP (oder beidem) agieren. Ein revers genetischer Ansatz mit einer Kollektion von bekannten MAMP/DAMP Rezeptor- und Co-Rezeptor Mutanten zeigte, dass die Perzeption sowie die Signaltransdkution wahrscheinlich bisher unbekannte molekulare Komponenten involviert.
 
Statistik