| dc.contributor.advisor | Wollnik, Bernd Prof. Dr. | |
| dc.contributor.author | Werner, Gesa | |
| dc.date.accessioned | 2021-09-24T08:44:58Z | |
| dc.date.available | 2021-09-30T00:50:28Z | |
| dc.date.issued | 2021-09-24 | |
| dc.identifier.uri | http://hdl.handle.net/21.11130/00-1735-0000-0008-591A-8 | |
| dc.identifier.uri | http://dx.doi.org/10.53846/goediss-8837 | |
| dc.identifier.uri | http://dx.doi.org/10.53846/goediss-8837 | |
| dc.language.iso | eng | de |
| dc.rights.uri | http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/ | |
| dc.subject.ddc | 570 | de |
| dc.title | Systematic Analysis of Molecular and Cellular Dysfunction in Accelerated Aging Phenotypes | de |
| dc.type | doctoralThesis | de |
| dc.contributor.referee | Wollnik, Bernd Prof. Dr. | |
| dc.date.examination | 2021-09-09 | |
| dc.description.abstractger | Zur Gruppe segmentaler progeroider Erkrankungen gehören genetische Erkrankungen, denen beschleunigte Alterungsprozesse in mehreren Geweben zugrunde liegen. Klinische Merkmale dieser Patienten sind altersassoziierte Pathologien in jungen Jahren wie graue Haare, Lipodystrophie, Osteoporose, grauer Star, Schwerhörigkeit, Arteriosklerose, Diabetes mellitus und Tumore. In den vergangenen Jahren wurden viele krankheitsverursachende Gendefekte für segmentale progeroide Erkrankungen identifiziert. Die betroffenen Proteine sind an Genomstabilität und der Funktion der Mitochondrien beteiligt. Die Identifizierung der zugrundeliegenden genetischen Defekte deckte molekulare und zelluläre Mechanismen auf, die unser Verständnis von Alterungspozessen und altersassoziierten Erkankungen im Allgemeinen erweiterte.
Das Ziel meiner Arbeit war, unser Wissen über diese zellulären und molekularen Mechanismen der Alterungsprozesse zu erweitern, indem ich eine einzigartige Sammlung von Fibroblasten und DNA-Proben von Patienten mit verschiedenen progeroiden Erkrankungen untersucht habe.
Dazu habe ich eine Methode zur Sequenzierung der mitochondrialen DNA mit sehr hoher Abdeckung etabliert, um niederfrequente mtDNA-Varianten in Patientenproben zu quantifizieren. Durch die Behandlung von Kontrollfibroblasten mit genotoxischen Substanzen konnte ich zeigen, dass dieser Ansatz die Detektion von niederfrequenten Varianten im mitochondrialen Genom möglich macht. Die Analyse einer DNA-Probe eines von Cutis Laxa Typ IC betroffen Patienten, der eine homozygote Mutation im LTBP4 Gen trägt, deckte eine signifikant erhöhte Anzahl an mtDNA-Varianten auf. LTBP4 kodiert ein sekretiertes Protein, das den TGF-beta Signalweg reguliert und das bisher noch nicht mit mitochondrialer Dysfunktion assoziiert war. Dieses Ergebnis weist auf eine Verbindung von LTBP4 und der Integrität des mitochondrialen Genoms hin.
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Weiterhin habe ich eine Real-Time PCR-basierte Methode zur Analyse der Telomerlänge etabliert und damit die Telomerlänge in DNA-Proben von Patienten gemessen, die an segmentalen progeroiden Erkrankungen leiden. So habe ich die erwartete sigmoidale Verteilung der Telomerlänge mit dem Alter und eine hohe Varianz der Telomerlänge in Kontrollproben zeigen können. Die Verkürzung der Telomerlänge in einer Probe eines Bloom-Syndrom-Patienten und einer Probe eines Patienten mit Cutis Laxa Typ 1C kommt der Signifikanz nahe.
Um die Verringerung der Telomerlänge detaillierter charakterisieren zu können, habe ich bei der Optimierung einer Telomer-qFISH-Methode kollaboriert und diese Methode dann eingesetzt, um die Telomerlänge in drei Fibroblasten von Bloom-Syndrom-Patienten zu messen. Erstaunlicherweise war in einer Patientenprobe die Signalintensität, die der Telomerlänge entspricht, und die Anzahl der Telomersignale erhöht. In dieser Patientenprobe konnte eine Chromosomenaberration und ein verzögerter Zellzyklus mit einer erhöhten Anzahl an Zellen in der G2/M-Phase nachgewiesen werden. Dies deutet darauf hin, dass der doppelte Chromosomensatz die Messung beeinträchtigte. Mit einem Southernblot konnte ich bestätigen, dass die Telomerlänge in diesen Patientenproben nicht verändert war.
Des Weiteren habe ich die Anreicherung von DNA-Schäden und die DNA-Reparatur in Patientenfibroblasten mittels der Quantifizierung der γH2AX Foci nach Bestrahlung etabliert und analysiert. So konnte ich eine erhöhte Anzal von γH2AX Foci in zwei unbehandelten Fibroblastenproben mit Mutationen in den Genen GORAB und SLC25A24 identifizieren, was auf eine höhrere Anfälligkeit für DNA-Schäden oder eine Schwäche der DNA-Reparatur hinweist. Des Weiteren hat die Bestrahlung signifikant mehr γH2AX Foci in zwei Patientenfibroblasten hervorgerufen, die Mutationen in den Genen PYCR1 und GORAB tragen, was ebenfalls auf eine Beeinträchtigung der DNA-Reparatur in diesen Zellen hindeutet.
Zusammengefasst habe ich in meiner Arbeit neue Methoden zur Quantifizierung von altersassoziierten zellulären Prozessen etabliert und diese Methoden genutzt, um Fibroblasten und DNA-Proben von Patienten mit segmentalen progeroiden Erkrankungen zu analysieren. So konnte ich neue Erkenntnisse zu den beteiligten Pathomechanismen gewinnen, indem ich eine Verbindung von LTBP4 mit der Integrität des mitochondrialen Genoms und einen potentiellen Einfluss von BLM und PYCR1 auf die Telomerlänge identifiziert habe. | de |
| dc.description.abstracteng | Accelerated aging in multiple tissues is the connecting characteristic of the group of genetic disorders called segmental progeroid syndromes. At young ages, affected patients show many clinical features of aging-associated pathologies such as hair graying, lipodystrophy, osteoporosis, cataracts, hearing loss, arteriosclerosis, diabetes mellitus, and malignancies. Several disease-causing genes for segmental progeroid syndromes have been identified within the last years, and the affected proteins are often involved in genome maintenance or mitochondrial function. Identifying these underlying genetic alterations revealed molecular and cellular mechanisms involved in the pathology of these diseases and furthered our understanding of aging processes and aging-associated diseases in general.
The aim of my thesis was to expand our knowledge of the cellular and molecular mechanisms of aging using a unique collection of fibroblast and DNA samples of patients suffering from a large variety of different progeroid syndromes.
I established an ultra-high coverage mtDNA sequencing approach to detect and quantify low-frequency mtDNA variants in patient samples. By treatment of control fibroblasts with genotoxic agents, I could show that this approach allows the detection of low-frequency variants in the mitochondrial genome. Analysis of a DNA sample of a patient suffering from Cutis laxa type IC and carrying a homozygous mutation in LTBP4 revealed a significantly increased number of mtDNA variants. LTBP4 encodes a secreted protein that regulates TGF-beta signaling and has previously not been associated with mitochondrial dysfunction. Therefore, these results indicate for the first time a link between LTBP4 and the integrity of the mitochondrial genome.
Additionally, I established a real-time PCR-based method in order to analyze telomere length in DNA samples of patients suffering from progeroid syndromes. I found the anticipated sigmoidal distribution of telomere length by age as well as a high variance of telomere length in the control samples. The decrease of telomere length in two patient samples, a Bloom syndrome patient and a patient suffering from Cutis laxa type IIB, approached significance.
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To characterize telomere attrition in more detail, I collaborated on the optimization of a telomere qFISH method, which I then used to measure telomere length in three fibroblast samples of Bloom syndrome patients. Strikingly, the telomere signal intensity corresponding to telomere length as well as the number of telomere signals were increased in one patient sample. A chromosomal aberration and a delayed cell cycle progression with an increased amount of cells in the G2/M phase were then detected in these fibroblasts, indicating that to the double set of chromosomes interfered with the measurement. A Southern blot confirmed that the telomere length in these patient samples was not different from the controls.
Further, I analyzed the accumulation of DNA damage and induction of the DNA damage response in patient fibroblasts using the quantification of γH2AX foci upon treatment with genotoxic reagents. I found an elevated level of γH2AX foci in two untreated fibroblast samples carrying mutations in GORAB and SLC25A24 indicative of either higher susceptibility of these cells to DNA damage or deficiencies in DNA damage repair processes. Further irradiation treatment caused a significantly elevated level of γH2AX in two fibroblast samples carrying mutations in the PYCR1 and GORAB genes suggestive of DNA damage repair impairment in these cells.
In summary, the results of my Ph.D. thesis help to establish new methods for the analysis and quantification of aging-associated cellular processes. Using these methods on cells and DNA samples of patients with segmental progeroid syndromes, I could provide new insights into the involved pathomechanisms by identifying a link between LTBP4 and mitochondrial DNA as well as a possible influence of BLM and PYCR1 on telomere length. | de |
| dc.contributor.coReferee | Rehling, Peter Prof. Dr. | |
| dc.subject.eng | Segmental Progeroid Syndromes | de |
| dc.subject.eng | mtDNA Sequencing | de |
| dc.subject.eng | Telomere Length Measurement | de |
| dc.identifier.urn | urn:nbn:de:gbv:7-21.11130/00-1735-0000-0008-591A-8-0 | |
| dc.affiliation.institute | Göttinger Graduiertenschule für Neurowissenschaften, Biophysik und molekulare Biowissenschaften (GGNB) | de |
| dc.subject.gokfull | Biologie (PPN619462639) | de |
| dc.description.embargoed | 2021-09-30 | |
| dc.identifier.ppn | 1771798785 | |