Einfluss von ARHGAP29 auf die Invasion von aggressiven und mesenchymal transformierten Mammakarzinomzellen
Influence of ARHGAP29 on the invasion of aggressive and mesenchymal transformed breast cancer cells
by Katharina Kolb
Date of Examination:2021-12-15
Date of issue:2021-12-06
Advisor:Prof. Dr. Carsten Gründker
Referee:Prof. Dr. Heidi Hahn
Referee:Prof. Dr. Margarete Schön
Persistent Address:
http://dx.doi.org/10.53846/goediss-8988
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Format:PDF
Description:Dissertation Katharina Kolb
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Abstract
English
Despite decades of scientific research and corresponding progress, breast cancer is still the most common carcinoma in women, in Germany and worldwide. Patients’ prognosis deteriorates drastically in metastatic stage. This is why therapeutic concepts preventing metastasis from the ground up are needed. Local invasion as the initial step required for metastasis is a potential target for this. In aggressive and mesenchymal transformed mammary carcinoma cells, the expression of the RhoA suppressing protein ARHGAP29 is increased. After induction of epithelial mesenchymal transition in breast cancer cells, it is again the only one of 32 GTPase activating enzymes to be significantly elevated in expression. Although ARHGAP29 is said to be important for invasion and metastasis of various carcinomas, no such role has yet been reported for the entity of breast carcinoma. Therefore, in this work, the influence of ARHGAP29 on the invasiveness of aggressive and mesenchymal transformed mammary carcinoma cells was investigated. For this purpose, the expression of ARHGAP29 in different breast cancer cell lines was first decreased using ARHGAP29 specific siRNA knockdowns. The efficiency of this was confirmed by gene and protein expression analyses. In vitro invasion assays in coculture with osteosarcoma cells demonstrated an effect of ARHGAP29 on the invasiveness of breast cancer cells. Reduction of ARHGAP29 expression resulted in significantly reduced invasion rates of the mammary carcinoma cell lines HCC1806, MCF-7-EMT and T-47D-EMT, but in turn in significantly enhanced invasiveness of the KRAS-mutated cell line MDA-MB-231. In proliferation analyses of the MDA-MB-231 and T-47D-EMT cell lines a significant effect of ARHGAP29 on proliferation abilities could not be shown, but for T-47D-EMT cells, there was a trend toward increased proliferation after ARHGAP29 knockdown. In turn, significantly elevated proliferation rates of the breast cancer cell lines HCC1806 and MCF-7-EMT were the result of the reduction in ARHGAP29 expression. Thus, it could be excluded that the effect on invasiveness was proliferation related. Interaction analyses showed AKT1 as potential interaction partner of ARHGAP29. Therefore, the expression of AKT1 after knockdown of ARHGAP29 was investigated using western blots. In western blots, significantly decreased ARHGAP29 expression or the trend toward reduced ARHGAP29 expression were conjoined with a significant decrease in AKT1 expression. Thus, ARHGAP29 was identified for the first time as a regulator of AKT1 expression. In summary, these results demonstrate for the first time the influence of ARHGAP29 on the invasion of aggressive and mesenchymal transformed mammary carcinoma cells and provide new evidence for the signalling cascade around ARHGAP29. Further intensive research is needed to fully uncover underlying mechanisms and to discover new ways for the therapeutic use of the demonstrated relationship.
Keywords: ARHGAP29; breast cancer; invasion; EMT; proliferation; AKT1
German
Trotz jahrzehntelanger Forschung und des dementsprechenden Fortschritts stellt das Mammakarzinom immer noch das häufigste Karzinom der Frau in Deutschland und weltweit dar. Mit der Fernmetastasierung verschlechtert sich die Prognose betroffener Patientinnen deutlich. Therapiekonzepte, die die Metastasierung von Grund auf verhindern, sind daher erforderlich. In der lokalen Invasion als initial erforderlichen Schritt zur Metastasierung besteht hierfür ein möglicher Angriffspunkt. In aggressiven und mesenchymal transformierten Mammakarzinomzellen ist das RhoA supprimierende Protein ARHGAP29 erhöht exprimiert. Nach Induktion von epithelial-mesenchymaler Transition in Mammakarzinomzellen ist es wiederum als einziges von 32 GTPase aktivierenden Enzymen signifikant erhöht exprimiert. Zwar wird ARHGAP29 eine Rolle in der Invasion und Metastasierung verschiedener Karzinome nachgesagt, jedoch ist dies bisher für die Entität des Mammakarzinoms nicht bekannt. Daher wurde im Rahmen dieser Arbeit der Einfluss von ARHGAP29 auf die Invasivität von aggressiven und mesenchymal transformierten Mammakarzinomzellen untersucht. Dafür wurde die ARHGAP29-Expression zunächst mithilfe von ARHGAP29 spezifischer siRNA-knockdowns in verschiedenen Mammakarzinomzelllinien vermindert und die Effizienz dessen mit Gen- und Proteinexpressionsanalysen bestätigt. Mit In-vitro-Invasionsassays in Kokultur mit Osteosarkomzellen konnte ein Einfluss von ARHGAP29 auf die Invasivität der Mammakarzinomzellen nachgewiesen werden. Die Verminderung der ARHGAP29-Expression führte zu signifikant erniedrigten Invasionsraten der Mammakarzinomzelllinien HCC1806, MCF-7-EMT und T-47D-EMT, wiederum aber zu einer signifikanten Verstärkung der Invasivität der KRAS-mutierten Zelllinie MDA-MB-231. Proliferationsanalysen der Zelllinien MDA-MB-231 und T-47D-EMT konnten keinen signifikanten Einfluss von ARHGAP29 auf die Proliferationsfähigkeiten nachweisen, bei T-47D-EMT-Zellen jedoch einen Trend zur verstärkten Proliferation nach ARHGAP29-knockdown. Die Proliferationsraten der Zelllinien HCC1806 und MCF-7-EMT wiederum konnten durch Expressionsreduktion von ARHGAP29 signifikant gesteigert werden. Damit konnte ausgeschlossen werden, dass der Effekt auf die Invasivität proliferationsbedingt zustande gekommen war. In durchgeführten Interaktionsanalysen stellte sich AKT1 als möglicher Interaktionspartner von ARHGAP29 dar. Daher wurde die Expression von AKT1 nach dem knockdown von ARHGAP29 in Western Blots untersucht. Die in den Western Blots signifikant verminderte ARHGAP29-Expression bzw. der Trend zur reduzierten ARHGAP29-Expression ging mit einer signifikant reduzierten AKT1-Expression einher. ARHGAP29 konnte damit erstmals als Regulator der Expression von AKT1 identifiziert werden. Zusammenfassend weisen die Ergebnisse dieser Arbeit erstmalig den Einfluss von ARHGAP29 auf die Invasion von aggressiven und mesenchymal transformierten Mammakarzinomzellen nach und liefern neue Hinweise für die Signalkaskade um ARHGAP29. Um zugrundliegende Mechanismen restlos aufzudecken und den aufgezeigten Zusammenhang therapeutisch nutzbar machen zu können, bedarf es weiterer intensiver Forschung.
Schlagwörter: ARHGAP29; Mammakarzinom; Invasion; EMT; Proliferation; AKT1
