Kristallographische Analyse von pathologischen Kristallen, Periplasmischen dömane von ligandfreien CitA Sensor Kinasen und PDI-verwandten Chaperone
Crystallographic Analysis of Pathological Crystals, Periplasmic Domain of Ligand-free CitA Sensor Kinase and PDI-related Chaperones
by Madhumati Sevvana
Date of Examination:2006-07-04
Date of issue:2006-11-08
Advisor:Prof. Dr. George M. Sheldrick
Referee:Prof. Dr. George M. Sheldrick
Referee:Prof. Dr. Isabel Usón
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Format:PDF
Description:Dissertation
Abstract
English
The current work reports on developing methods to elucidate crystal structure of nonmerohedrally twinned protein crystals and analysis of structures of different proteins that mediate signal transduction.Non-merohedral twinning is one among the several pathological cases encountered rarely during crystal structure analysis. Processing X-ray data from non-merohedrally twinned small molecule crystals has been a routine method for several years. The existing small-molecular methods were successfully extended to solve two twinned test protein structures, namely Bovine Insulin (BI-Zwilling) and Glucose Isomerase (GIDrilling), using Single Wavelength Anomalous Scattering (SAD) with in-house data.Bacterial response to external stimuli is mediated by several signal transduction systems, which are vital for their survival. These systems are termed two component systems or histidine protein kinases in prokaryotes. Two component systems offer themselves as new drug targets, because they have not been identified in mammalian systems or/and animal kingdom. In the present study the crystal structure of merohedrally twinned ligand-free periplasmic domain of the citrate sensor, CitA from Klebsiella pneumoniae was determined. Klebsiella pneumoniae is the major cause of pneumonia, nosocomial infections, sepsis and urinary tract infections. Comparison of structures of the ligand-free and ligand-bound CitA domains, shed light on some mechanistic aspects of the citrate sensor signal transduction system.Wind, a product of windbeutel gene and a member of the PDI-related chaperone family, is one of the several genes required for dorso-ventral polarization in the developing embryo of Drosophila melanogaster. Dorso-ventral polarization requires communication between somatic cell derived follicle cells and germ-line derived oocyte, which occurs through a cascade of signal transduction steps called the Gurken-EGFR pathway. A previously determined crystal structure of Wind, suggested a homodimer with the dimerization interface along the N-terminal b-domain, which has the characteristic thioredoxin fold. Pipe, a product of pipe, was identified to be the potential interacting partner of the Wind dimer and a putative substrate binding site on Wind was characterized. Crystal structures of several non-functional mutants of Wind and a Wind-peptide complex indicated Wind-Pipe interaction to be, mainly due to the aromatic and/or hydrophobic behaviour of the substrate binding site and conservation of the dimerization interface. Crystal structure of human ERp29, a close relative of Wind, revealed a similar three dimensional architecture and conservation of the dimerization interface.
Keywords: X-ray Structure analysis; Non-Merohedral; Merohedral; Twin; SAD; Two component systems; Histidine-protein kinases; Klebsiella pneumoniae; Sensor Kinases; Signal transduction; Wind PDI-related Chaperones; Chaperones; Thiredoxin; Drosophila
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Die vorliegende Arbeit berichtet über die Erarbeitung von Verfahren, um nicht-merohedrisch verzwillingte Proteinkristalle zu erklären. Aüserdem wird die Strukturanalyse verschiedener Proteine behandelt, die Signaltransfer vermitteln.Nicht-merohedrische Verzwilligung tritt bei der Kristallstrukturanalyse äüserst selten auf. Für nicht-merohedrisch verzwillingte Kleinmolekülkristalle ist die Auswertung der Daten ihrer Röntgenanalyse schon seit einigen Jahren Routine. Bestehende Methoden für Kleinmoleküle wurden dahingehend erweitert, dass zwei verzwillingte Testproteinstrukturen, nämlich Rinder-Insulin (BI-Zwilling) und Glukoseisomerase (GI-Drilling), gelöst werden konnten. Bei der Auswertung wurde das Verfahren anomaler Streuung bei Einfrequenzstrahlung auf Daten angewandt, die an einer Drehanode gemessen wurden.Die bakterielle Antwort auf externe Stimulation wird durch mehrere lebensnotwendige Signaltransfersysteme vermittelt. In Prokaryoten werden diese Systeme Zweikomponentensysteme oder Histidin-Protein-Kinasen genannt. Zweikomponentensysteme bieten sich als Ziele zur Entwicklung neuer Medikamente an, da sie in Säugetiersystemen und/oder im Tierreich noch nicht identifiziert wurden. In der vorliegenden Studie wurde die Kristallstruktur der merohedrisch verzwillingten, ligandenfreien, periplasmischen Domäne des Zitratsensors, CitA, von Klebsiella pneumoniae, bestimmt. Klebsiella pneumoniae ist die Hauptursache von Lungenentzündungn, nosokomialer Infektionen, Blutvergiftungen und Infektionen der Harnröhre. Der Vergleich der Strukturen ligandenfreier und ligandengebundener CitA-Domänen warf ein Licht auf einige mechanistische Aspekte des Signaltransfersystemes des Zitratsensors.Wind, ein Produkt des Windbeutel-Genes und Mitglied der Familie der PDI-verwandten Chaperone, ist eines von mehreren Genen, die notwendig für die dorso--ventrale Polarisierung in der Entwicklung des Embryos von Drosophila melanogaster sind. Dorso-ventrale Polarisierung erfordert die Kommunikation zwischen somatischen Zellen, die aus Folikelzellen abgeleitet sind, und Eizellen, die aus der Keimbahn abgeleitet sind. Sie erfolgt durch eine Kaskade an Signaltransferschritten, die Gurken-EGFR-Signalweg genannt wird. Eine zuvor bestimmte Struktur von Wind schlägt einen Homodimer vor, der eine Dimerisierungsschnittstelle entlang der N-terminalen b-Domäne aufweist. Diese hat die charakteristische Faltung von Thioredoxin. Pipe, ein Produkt von pipe, wurde als potentieller Wechselwirkungspartner des Wind-Dimers identifiziert. Eine mögliche Substratbindungsstelle auf Wind wurde beschrieben. Kristallstrukturen mehrerer nicht-funktioneller Mutationen von Wind sowie ein Wind-Peptide-Komplex deuten an, dass die Wind-Pipe-Wechselwirkung vorwiegend auf aromatischem und/oder hydrophobem Verhalten der Substratbindestelle und Erhaltung der Dimerisierungsschnittstelle basiert. Die Kristallstruktur von ERp29, einem engen Verwandten von Wind, offenbart eine ähnliche dreidimensionale Architektur und Erhaltung der Dimerisierungsschnittstelle.
Schlagwörter: Roentgenstrukturanalyse; Nicht-Merohedrische; Merohedrische; Zwilling; SAD; Zweikomponentensysteme; Histidin-Protein-Kinasen; Klebsiella pneumoniae; Sensor Kinasen; Signaltransfersysteme; Wind PDI-verwandten Chaperone; Chaperone; Thioredoxin; Drosophila