Dense-core vesicle maturation at the Golgi-endosomal interface in Caenorhabditis elegans
Reifung von
von Mandy Hannemann
Datum der mündl. Prüfung:2012-04-17
Erschienen:2012-06-08
Betreuer:Prof. Dr. Stefan Eimer
Gutachter:Prof. Dr. Stefan Eimer
Gutachter:Prof. Dr. Reinhard Jahn
Gutachter:Prof. Dr. Nils Brose
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Format:PDF
Zusammenfassung
Englisch
Fast synaptic transmission is mediated by the triggered release of neurotransmitters from synaptic vesicles (SVs). To regulate synaptic transmission and neuronal activity, neurons also release neuropeptides and hormones from dense-core vesicles (DCVs). While SVs can be recycled, DCVs have to be newly synthesized in the cell body after release. DCVs are believed to be generated at the trans-Golgi network (TGN) as immature DCVs, which subsequently undergo a maturation process through clathrin-mediated membrane remodeling events. This maturation process is required for efficient processing of neuropeptides within DCVs and removal of factors that would otherwise interfere with DCV release. It has been shown that only mature DCVs are able to undergo stimulus-dependent exocytosis. Previously, we showed that the small Rab GTPase, RAB-2, and its effector, RIC-19/ICA69, are involved in neuronal DCV maturation in Caenorhabditis elegans. In rab-2 mutants, specific cargo is lost from maturing DCVs and mis-sorted into the endosomal-lysosomal degradation route. This cargo loss could be prevented by blocking endosomal delivery. This suggested that RAB-2 is involved in retention of DCV components during the sorting process at the Golgi-endosomal interface. To understand how RAB-2 activity is regulated at the Golgi, we screened for RAB-2 specific GTPase activating proteins (GAPs). We identified a potential RAB-2 GAP, TBC-8, which is exclusively expressed in neurons, and when depleted, shows similar DCV maturation defects as rab-2 mutants. We could demonstrate that RAB-2 binds to its putative GAP, TBC-8. Furthermore, we found novel factors involved in DCV maturation, RUND-1 and CCCP-1. Interestingly, both RAB-2 effectors, RUND-1 and RIC-19, interacted with the negative regulator of RAB-2, the GAP TBC-8, in binding studies. Therefore, RAB-2 might recruit its own GAP via its effector complex, which would enhance its deactivation. This suggests that the regulation of RAB-2 at the Golgi is highly-dynamic during DCV maturation. This negative feedback loop might represent a novel mechanism to regulate Rab function. Moreover, we have shown for the first time that retrograde trafficking is also required during DCV maturation by analyzing the involvement of the multi-subunit Golgi-associated retrograde protein (GARP) tethering complex. We propose that active RAB-2 might facilitate the reception of retrograde trafficking vesicles delivered back to the maturing DCV compartment at the Golgi-endosomal interface. All these findings indicate that DCV maturation is a highly-regulated process that relies on the cooperation of various proteins, such as Rab GTPases and large multi-subunit tethering complexes.
Keywords: C. elegans; Golgi; Dense-Core-Vesicle; Maturation; Neuropeptides; Intracellular Trafficking; Rab GTPase; GAP; GARP; Retrograde Transport
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Schnelle synaptische Reizübertragung wird
durch die gesteuerte Freisetzung von Neurotransmittern aus
synaptischen Vesikeln (SV) vermittelt. Um synaptische
Reizübertragung und neuronale Aktivität zu regulieren, setzen
Neurone zusätzlich Neuropeptide und Hormone aus „Dense-Core“
Vesikeln (DCV) frei. Während SV recycelt werden können, müssen DCV
nach ihrer Freisetzung in den neuronalen Zellkörpern neu generiert
werden. Es wird angenommen, dass DCV am trans-Golgi-Netzwerk (TGN)
als unreife DCV entstehen, die nachfolgend einen Reifungsprozess
durchlaufen, der für eine effiziente Prozessierung der Neuropeptide
innerhalb der DCV erforderlich ist. Des Weiteren werden bei diesem
Prozess Faktoren entfernt, die die Freisetzung der DCV behindern
würden. Im Vorfeld konnten wir bereits zeigen, dass die kleine Rab
GTPase, RAB-2, und deren Effektor, RIC-19/ICA69, an der Reifung von
neuronalen DCV in Caenorhabditis elegans involviert sind. In rab-2
Mutanten geht spezifisches Cargo aus den reifenden DCV verloren, da
es fälschlicherweise in den endosomalen-lysosomalen Abbauweg
geleitet wird. Interessanterweise konnte dieser Cargo-Verlust durch
eine Blockade des endosomalen Abbauweges verhindert werden. Dies
weist darauf hin, dass RAB-2 an der Zurückhaltung von DCV
Komponenten während des Sortierungsprozesses im Übergangsbereich
zwischen Golgi und Endosomen involviert ist. Um zu verstehen wie
die Aktivität von RAB-2 am Golgi reguliert wird, entschieden wir
uns dazu, nach RAB-2 spezifischen GTPase Aktivierungsproteinen
(GAP) zu suchen. Wir identifizierten TBC-8 als einen potentiellen
RAB-2 GAP, der exklusiv in Neuronen exprimiert wird. Würmer, die
kein tbc-8 exprimieren, zeigten ähnliche DCV Reifungsdefekte wie
rab-2 Mutanten. Zudem konnten wir nachweisen, dass RAB-2 an TBC-8
bindet. Weiterhin identifizierten wir neue Faktoren, die an der
Reifung von DCV beteiligt sind. RUND-1 zum Beispiel ist wie RIC-19
ein RAB-2 Effektor und interessanterweise interagierten beide
Effektoren mit dem GAP, TBC-8, in Bindestudien. Daher ist es
möglich, dass RAB-2 sein GAP mit Hilfe des eigenen
Effektorkomplexes rekrutiert, was zu einer beschleunigten
Deaktivierung von RAB-2 führt. Diese negative Rückkopplung könnte
einen neuen Mechanismus zur Regulation von Rab-Funktionen
darstellen und spricht für eine äußerst dynamische Regulierung von
RAB-2 am Golgi während der Reifung von DCV. Des Weiteren haben wir
zum ersten Mal gezeigt, dass auch retrograder Proteintransport,
welcher durch den GARP-Komplex gesteuert wird, während der Reifung
von DCV benötigt wird: Wir vermuten, dass aktives RAB-2 den Empfang
von retrograden Transportvesikeln, die zurück zu dem reifenden
DCV-Kompartiment transportiert werden, ermöglicht. All diese
Ergebnisse zeigen, dass die Reifung von DCV ein stark regulierter
Prozess ist, der auf das Zusammenspiel verschiedener Proteinen wie
Rab GTPasen und großen Proteinkomplexen angewiesen ist.
Schlagwörter: C. elegans; Golgi; Dense-Core-Vesikel; Reifung; Neuropeptide; Intrazelluläres Trafficking; Rab GTPase; GAP; GARP; Retrograder Transport