Electron microscopic localization of tagged proteins in the yeast S. cerevisiae spliceosomal U4/U6.U5 trisnRNP

Abstract

Das Spleißen der prä-mRNA wird von einer makromolekularen Maschine, dem Spleißosom katalysiert. Das Spleißosom wird schrittweise aus den kleinen nukleären Ribonukleoprotein-Partikeln, den sogenannten U1, U2, U5 und U4/U6 snRNPs sowie zahlreichen nicht-snRNP Spleißfaktoren assembliert. Die snRNPs bestehen aus einem RNA-Molekül (bzw. zwei weitgehend basengepaarten RNAs im Fall von U4/U6) und mehreren Proteinkomponenten. Die Assemblierung des Spleißosoms beginnt mit der Bildung des Prä-Spleißosoms (Komplex A) durch die Interaktion des U1 snRNPs mit der 5 Spleißstelle und des U2 snRNPs mit dem Verzweigungspunkt. Die Integration von U5 und U4/U6 in Form eines U4/U6.U5 tri-snRNPs schließt die Assemblierung des Spleißosoms ab (prä-katalytisches Spleißosom oder Komplex B). Der tri-snRNP ist ein wichtiger und evolutionär stark konservierter Baustein des Spleißosoms. Einige der mindestens 28 Proteine des tri-snRNPs aus der Hefe S. cerevisiae spielen eine wichtige Rolle beim Spleißen der prä-mRNA. Während der katalytischen Aktivierung des Spleißosoms wird das komplizierte Netzwerk der Protein-Protein-, Protein-RNA- und RNA-RNA-Interaktionen des tri-snRNPs stark verändert. Ein erster wichtiger Schritt der Aktivierung ist die Entwindung der U4/U6 snRNAs. Nur so kann dann die U6 snRNA mit der 5 Spleißstelle der prä-mRNA und mit der U2 snRNA interagieren, wodurch ein Teil des katalytischen Zentrums des Spleißosoms gebildet wird. Es konnte gezeigt werden, dass die U5-spezifischen Proteine Prp8p, die ATPase Brr2p und die GTPase Snu114p direkt an der Entwindung der U4/U6 snRNAs beteiligt sind, und dass dieser Prozess einer strengen Kontrolle unterliegen muss. Es ist jedoch nur wenig bekannt über die Struktur des Hefe tri-snRNPs und seinen molekularen Aufbau. Deshalb haben wir die strukturellen Details des Hefe tri-snRNPs mittels Elektronenmikroskopie untersucht und verschiedene funktionell wichtige U5-, U4/U6- und tri snRNP-spezifische Proteine in ihrer zweidimensionalen Verteilung lokalisiert. Dazu verwendeten wir zwei verschiedene Markierungs-Methoden: (i) Antikörper-Markierung und (ii) genetische Markierung mit einem globulären Protein (54 kDa), das unter dem Elektronenmikroskop direkt sichtbar war. Mit Hilfe dieser beiden Methoden konnten wir die C terminalen Bereiche von sieben Proteinen eindeutig innerhalb der nativen Struktur des tri snRNPs lokalisieren und die Untereinheiten des Komplexes identifizieren. Brr2p wurde in der kopf-ähnlichen Struktur, die C Termini von Prp8p und Snu114p wurden dagegen im zentralen Bereich des Hauptkörpers lokalisiert, welcher daher wahrscheinlich das U5 snRNP enthält. Eine kleinere Arm-Domäne ist über ein Gelenk mit dem zentralen Teil des Hauptkörpers verbunden. In diesem Arm befinden sich die U4/U6 Proteine Prp3p und Lsm8p, woraus wir schließen, dass der Arm das U4/U6 snRNP enthält. Im Gelenk wurden Prp6p und Prp31p lokalisiert, die wahrscheinlich die Interaktion von U5 mit U4/U6 vermitteln. Durch die Kombination von in vivo Markierungs-Methoden und Elektronenmikroskopie ermöglichen wir erstmalig wichtige Einblicke in die detaillierte strukturelle Organisation des tri-snRNPs aus der Hefe. Darüber hinaus lassen diese Daten Schlüsse auf mögliche Interaktionen der tri-snRNP Proteine zu, die zur Entwindung der U4/U6 snRNA führen.