Probing vesicle dynamics within small synapses
Untersuchung der Vesikelbewegung in kleinen Synapsen
by Edward A. Lemke
Date of Examination:2005-04-27
Date of issue:2006-01-27
Advisor:Prof. Dr. Erwin Neher
Referee:Prof. Dr. Jürgen Troe
Referee:Prof. Dr. Erwin Neher
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Format:PDF
Description:Dissertation
Abstract
English
Sustained synaptic transmission at the hippocampal synapse (Ø∼1 μm) requires continuous exocytosis and subsequent endocytosis of synaptic vesicles (Ø∼35 nm). The kinetics of this process have been widely studied, however, due to a lack of appropriate techniques, little is known about the mobility of small vesicles within the synapse. Fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) was introduced by Jordan (2000) to study vesicle dynamics in resting synapses. This study is supplemented here with Monte-Carlo simulations to propose a quantitative model of vesicle mobility. Vesicle movement was found to be slow with a diffusion coefficient of 5 •10-5 μm2/s and restricted to a cage of ∼50 nm. The effects of disabling motor proteins and treatment with a phosphatase blocker on vesicle dynamics were also analyzed using simulations.Furthermore, the development of a single particle technique used to monitor single fluorescently labelled vesicles both, at rest and during stimulation of the synapse, is described. An automated algorithm identified single vesicles and tracked their movement in real-time. Vesicle mobility was studied in specific vesicle populations that differed in their mode of endocytosis from the plasma membrane. Results from the particle tracking and the FFS study were found to be in good agreement. Vesicle mobility was observed to increase, but was still slow during stimulation.Additionally, a theoretical investigation of the performance of single photon counting devices with dead-time for the task of single particle tracking was performed. A Maximum Likelihood based algorithm is presented which allows to determine the position of single subresolution fluorescent particles, and yields a precision higher than expected from the total number of photons collected with these detectors.
Keywords: fluorescence microscopy; fluorescence spectroscopy; particle tracking; single vesicles; synapses
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Dauerhafte synaptische Transmission an der hippocampalen Synapse (Ø∼1 μm) beruht auf der Exocytose von synaptischen Vesikeln (Ø∼35 nm), welche gleichzeitig an ihre darauffolgende Endocytose gekoppelt ist. Die Kinetik dieser Prozesse werden seit längerem untersucht, jedoch weiss man nur sehr wenig über die Mobilität dieser Vesikel innerhalb der Synapse, da sie sehr klein sind und entsprechende Techniken fehlen. Fluoreszenz-Fluktuations-Spektroskopie (FFS) zur Untersuchung der Dynamik von Vesikeln in unstimulierten Synapsen wurde von Jordan (2000) eingeführt. Diese Methode wurde in der vorliegenden Arbeit durch Monte-Carlo- Simulationen ergänzt, um ein quantitatives Modell der Vesikel-Beweglichkeit vorschlagen zu können. Die Vesikel-Bewegung war langsam mit einem Diffusionskoeffizienten von 5 •10-5 μm2/s und begrenzt auf einen Käfig von ∼50 nm. Die Auswirkungen der Deaktivierung von Motor-Proteinen und der Behandlung mit Phosphatase-Inhibitoren auf die Vesikel-Beweglichkeit wurden durch Simulationen analysiert.Weiterhin ist die Entwicklung einer single particle tracking Technik beschrieben, die es erlaubt, einzelne, mit Fluoreszenzfarbstoff markierte Vesikel sowohl in unstimulierten als auch stimulierten Synapsen zu untersuchen. Ein automatisierter Algorithmus identifiziert einzelne Vesikel und verfolgte ihre Bewegung in Echtzeit. Die Mobilität von verschiedenen Vesikel-Populationen wurde untersucht, welche sich durch den Endozytose-Modus unterscheiden, mit dem sie von der Plasmamembran wiederaufgenommen wurden. Die Ergebnisse des particle trackings und der FFS-Studie sind im Einklang. Die Beweglichkeit von Vesikeln konnte durch Stimulation der Synapse leicht erhöht werden.Weiterhin ist eine theoretische Studie zur Leistungsfähigkeit von Einzel-Photonen-Zählwerken mit Totzeit für die Anwendung in der single particle tracking Technik beschrieben. Ein Maximum Likelihood basierter Algorithmus wird beschrieben, der es erlaubte, die Position von einem Objekt, das kleiner als das Auflösungvermögen des Mikroskopes ist, genauer zu bestimmen als man es von der Gesamtzahl der detektierten Photonen erwarten würde.
Schlagwörter: Fluoreszenz Mikroskopie; Positionsbestimmung; Fluoreszenz Spektroskopie; einzelne Vesikel; Synapsen