Regulation of recycling endosomal membrane traffic by a γ-BAR/ kinesin KIF5 complex
Regulation des recycling endosomalen Membrantransports durch einen Komplex aus γ-BAR und Kinesin KIF5
von Michael Schmidt
Datum der mündl. Prüfung:2007-11-22
Erschienen:2008-01-15
Betreuer:Prof. Dr. Volker Haucke
Gutachter:Prof. Dr. Volker Haucke
Gutachter:Prof. Dr. Reinhard Jahn
Gutachter:Dr. Dieter Klopfenstein
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Name:schmidt_michael.pdf
Size:5.08Mb
Format:PDF
Description:Dissertation
Zusammenfassung
Englisch
Intracellular trafficking of membrane proteins and lipids between different compartments is a fundamental process underlying a variety of cell physiological functions of eukaryotic cells. Protein sorting along the secretory and endocytic pathways depends on the presence of different types of endosomal organelles. Recycling endosomes (REs) comprise a collection of vesiculo-tubular membranes that are often found in association with microtubules. In most cell types, they are concentrated in the perinuclear area in close proximity to the trans-Golgi network. REs mediate constitutive recycling of plasma membrane proteins, for example the transferrin receptor (TfR), but have also been implicated in the regulation of other cellular processes ranging from cytokinesis over morphogenesis to cellular polarity and long term synaptic plasticity. The aim of this thesis was to analyze the role of γ-BAR, a recently identified protein that interacts with the γ-ear domain of the clathrin adaptor complex AP-1 and is implicated in post-Golgi/ endosomal trafficking events. We found that γ-BAR association with membranes is mediated by post-translational palmitoylation of three cysteine residues at its amino-terminal end. Furthermore, we discovered that γ-BAR localizes to recycling endosomal membrane profiles and associates with the microtubule-based motor protein kinesin KIF5 via direct binding to its light chains, thereby regulating RE dynamics. Overexpression of γ-BAR caused a relocalization of Rab11- and TfR- containing REs to the cell periphery and to axonal clusters in hippocampal neurons. This phenomenon was dependent on the presence of intact microtubules and functional kinesin KIF5 motor proteins. Furthermore, γ-BAR overexpression delayed recycling of transferrin (Tf) to the cell surface and impaired axonal outgrowth in developing hippocampal neurons. Conversely, siRNA mediated knockdown of γ-BAR facilitated Tf recycling as well as axonal outgrowth. These results identify γ-BAR as a molecular link between the endosomal recycling compartment and the microtubule-based transport machinery. We propose that a γ-BAR - kinesin KIF5 complex regulates the intracellular positioning and transport of recycling endosomes. Thus, it might be implicated in diverse cell physiological processes known to involve REs.
Keywords: intracellular membrane trafficking; adaptor proteins; recycling endosomes; kinesin; microtubule based transport
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Der intrazelluläre Transport von Membranproteinen und lipiden zwischen verschiedenen Zellkompartimenten ist die Grundlage für eine Reihe zellphysiologischer Funktionen eukaryontischer Zellen. Der gerichtete Transport von Proteinen über den sekretorischen oder endozytischen Weg ist abhängig von der Gegenwart verschiedener endosomaler Organellen. Recycling-Endosomen (REs) beinhalten eine Vielzahl vesikulär-tubuläre Membranstrukturen, welche oft in Assoziation mit Mikrotubuli zu finden sind. In den meisten Zellarten sind sie in der Nähe des Zellkerns und sehr nah am trans-Golgi-Netzwerk lokalisiert. REs sind für das ständige Recycling von Membranproteinen wie beispielsweise dem Transferrin Rezeptor (TfR) verantwortlich, wurden aber auch schon mit der Regulation anderer zellulärer Prozesse in Verbindung gebracht. Diese Prozesse reichen von Zytokinese, über Morphogenese, bis hin zu Zellpolarität und lang anhaltender synaptischer Plastizität. Ziel der vorliegenden Arbeit war die funktionelle Charakterisierung von γ-BAR, einem kürzlich identifizierten Protein, welches mit der γ-Ohr-Domäne des Clathrin-Adaptorkomplexes AP-1 interagiert und somit am post-Golgi/ endosomalen Transportweg beteiligt ist. Wir fanden heraus, dass γ-BAR aufgrund der Palmitoylierung dreier kritischer Cysteinreste im Amino-Terminus des Proteins an Membranen gebunden ist. Außerdem entdeckten wir, dass γ-BAR in Recycling-endosomalen Membranfraktionen lokalisiert und mit dem mikrotubulibasierten Motorprotein KIF5 durch direkte Bindung an dessen leichten Ketten assoziiert ist, womit es in der Lage ist, die Dynamik von REs zu regulieren. Die Überexpression von γ-BAR führte zu einer Relokalisation von Rab11- und TfR-haltigen REs zur Zellperipherie und zu axonalen Clustern in Neuronen des Hypocampus. Dieses Phänomen war abhängig von der Gegenwart intakter Mikrotubuli und funktionellen Kinesin KIF5 Motorproteinen. Außerdem verlangsamte die Überexpression von γ-BAR das Recycling von Transferrin (Tf) zur Zelloberfläche und beeinträchtigte das axonale Wachstum sich entwickelnder Neuronen des Hypocampus. Umgekehrt beschleunigte ein siRNA induzierter knock-down von γ-BAR sowohl das Recycling von Tf als auch das axonale Wachstum. Aufgrund dieser Ergebnisse identifizierten wir γ-BAR als molekulare Verbindung zwischen dem endosomalen Recyclingkompartiment und der mikrotubulibasierten Transportmaschinerie. Wir nehmen an, dass ein γ-BAR Kinesin KIF5 Komplex die intrazelluläre Positionierung und den Transport von Recycling-Endosomen reguliert. Es könnte daher in einer Vielzahl physiologischer Prozesse involviert sein, an welchen Recycling-Endosomen beteiligt sind.
Schlagwörter: intrazellulärer Membrantransport; Adaptorproteine; Recycling-Endosomen; Kinesin; Mikrotubuli-basierter Transport