Glutamate-induced reversal of dopamine transport is mediated by the PKC signalling pathway

Abstract

Dopaminerge Neuronen setzen ihre Transmitter nicht nur von den Axonterminals im Striatum frei, sondern auch von ihren langen apikalen Dendriten in der substantia nigra pars reticulata (SNr). Ob die dendritische Freisetzung von Dopamin durch Exozytose oder durch die Umkehrung des Dopamintransporters (DAT) geschieht, ist nach wie vor umstritten. Vorangehende Studien zeigten, dass die Glutamat-induzierte Freisetzung von Dopamin durch den DAT keine ionotropen Glutamatrezeptoren erfordert. In dieser Studie erforschten wir daher die Rolle von metabotropen Glutamatrezeptoren (mGluRs) für der Freisetzung von dendritischem Dopamin durch den DAT. Wir benutzten Amperometrie, um die Freisetzung von Dopamin in Gehirnschnitten aus dem Mittelhirn von Ratten zu messen. Glutamat induzierte die Freisetzung von Dopamin durch den DAT und wurde reversibel durch Chelerythrin, einen Inhibitor der Proteinkinase C (PKC), blockiert. Ein selektiver Gruppe I mGluR-Agonist induzierte die Freisetzung von Dopamin und wurde reversibel durch den DAT-Antagonisten GBR12935 blockiert. Ferner war der PKC-Aktivator PMA ebenfalls in der Lage, eine DAT-vermittelte Freisetzung von Dopamin hervorzurufen. Die PKC-induzierte Freisetzung von Dopamin war bisher mit dem Effekt von Amphetamin auf den DAT in Verbindung gebracht worden, jedoch nicht mit der physiologischen Aktivierung von mGluRs. Um die Elemente der Signalkaskade in der Zelle weiter zu untersuchen, erzeugten wir stabil transfizierte SH-SY5Y Zellen, die humanen DAT (SH-DAT) exprimieren. Elemente der mGluRI Signalkaskade waren in der Lage, die Freisetzung von Dopamin zu induzieren und wurden durch Chelerythrin blockiert. Um die Rolle N-terminaler Phosphorylierung des DAT für die hier untersuchte Freisetzung von Dopamin zu untersuchen, generierten wir eine neue stabil transfizierte Zelllinie, die einen um die ersten 19 Aminosäuren gekürzten Dopamintransporter (SH-D19) exprimierte. Fünf N-terminale Serine, die mögliche PKC-Phosphorylierungsstellen sind, wurden dadurch entfernt. Jedoch war die PKC-induzierte Freilassung von Dopamin in diesen SH-D19 Zellen weiterhin möglich. Der PKC-induzierte Dopaminausfluss in den SH-DAT Zellen wurde dagegen durch den nicht-selektive Kationenkanalblocker Lanthanum (La+3) blockiert. Unsere Forschungsergebnisse deuten darauf hin, dass PKC-induzierte Dopaminfreisetzung nicht durch DAT-Phosphorylierung auftritt. Stattdessen wird möglcherweise ein Natriumeinstrom nach der PKC-Aktivierung benötigt. Dieser könnte durch PKC-abhänige Kationskanäle, wie die transient receptor potential (TRP) Kanäle, vermittelt werden. In dieser Arbeit zeigen wir, dass die Aktivierung einer Signalkaskade zu einer Umkehrung des DAT führt. Da metabotrope Rezeptoren im Nervensystem weithin exprimiert sind, könnte dieses Phänomen auch an anderen Stellen und mit anderen Neurotransmittern auftreten. Darüberhinaus weist diese Studie darauf hin, dass die Freisetzung von Neurotransmittern nicht auf einen presynaptischen Ort limitiert ist.