Combining induced protease fragment assembly and microarray analysis to monitor signaling in living cells.
Combining induced protease fragment assembly and microarray analysis to monitor signaling in living cells.
by Anna Botvinnik
Date of Examination:2009-06-25
Date of issue:2009-11-19
Advisor:PD Dr. Moritz Rossner
Referee:Prof. Dr. Klaus-Armin Nave
Referee:Prof. Dr. Frauke Melchior
Referee:Prof. Dr. Ernst A. Wimmer
Persistent Address:
http://dx.doi.org/10.53846/goediss-3281
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Format:PDF
Description:Dissertation
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Abstract
English
The ability to monitor multiple signaling events simultaneously in living cells is essential to better understand complex biological processes. So far, DNA-microarray technologies provide global scale data mainly restricted to the level of gene expression. This information is not sufficient to understand the upstream regulatory mechanisms that lead to gene expression changes. Most proteomic technologies also provide large scale measurement but usually depend on in vitro synthesized peptides or require biochemical manipulations. High throughput technologies are required for functional characterization and monitoring of signaling components in living cells. Here, an experimental approach is presented termed EXTassay that enables quantitative and parallel measurements of various signaling events upstream of mRNA expression. EXTassay incorporates various cellular assays that are coupled to reporter gene expression. To achieve multiplexing, we have generated a complex and optimized library of short expressed oligonucleotide tags (EXTs). Each unique EXT can replace a classical reporter gene and serves as a unique identifier for tracking and quantification of a defined cellular assay. Multiple EXT-reporters expressed in the same cell or cell population can be isolated and analyzed by custom microarray hybridization. We have established protocols and optimized the microarray readout for reliable EXT quantification. We applied the EXTassay to analyze the neuregulin 1 induced ErbB receptor tyrosine kinase signaling in PC-12 cells. We used transcriptionally coupled split TEV protein complementation assays to monitor ErbB receptor dimerization and phosphorylation dependent interaction with downstream signaling proteins. In addition, we employed 30 different cis-regulatory elements to assess the downstream signaling. All assays were coupled to unique EXTs and analyzed by microarrays. By analyzing three different receptor complexes (ErbB 2/2, 2/3 and 2/4), we were able to measure receptor specific differential signaling effects and demonstrate that EXTassays can be applied for the quantitative profiling of activated signaling pathways.
Keywords: ERBB; microarray; signal transduction; high throughput; reporter gene; cis-element; TEV
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Die Fähigkeit Signalkaskaden zu vermessen ist für das Verständnis komplexer biologischer Prozesse essentiell. Bis jetzt versorgt uns die DNA Microarray Technologie mit umfassenden Daten, deren Auflösung jedoch auf der Ebene der Genexpression endet. Diese Informationen reichen nicht aus um die vorgeschalteten regulatorischen Mechanismen der Genexpression zu verstehen. Die meisten proteomischen Technologien hängen von in vitro synthetisierten Peptiden ab oder benötigen weitere biochemische Manipulationen. Für die Charakterisierung und Beobachtung einzelner Bestandteile von Signalkaskaden in lebenden Zellen sind Hochdurchsatz-Verfahren notwendig. In der vorliegenden Arbeit wird ein experimentelles Verfahren namens EXTassay beschrieben, dass eine quantitative und parallele Messung multipler Signal-Ereignisse ermöglicht, die der mRNA Expression vorgelagert sind. EXTassays vereinen verschiedene zelluläre Assays, die an die Reporter Gen Expression gekoppelt sind. Um Multiplexing zu erreichen wurde eine komplexe und optimierte Bibliotek kurzer expressed oligonucleotide tags (EXTs) generiert. Jedes einzelne EXT ersetzt hierbei ein klassisches Reportergen und dient als eindeutiger Identifikator für einen definierten zellulären Assay. Es können verschiedene EXTs, die entweder in einer Zelle oder in einer Zellpopulation exprimiert sein können, über Microarray Hybridisierung analysiert werden. In dieser Arbeit wurden Protokolle für das verlässliche Auslesen von Microarrays für EXTs optimiert. Weiterhin wurden EXT-basierte Assays verwendet, um die durch Neuregulin-1 induzierte Dimerisierung und Aktivierung von Rezeptortyrosinkinasen der ErbB Familie zu untersuchen. Für die quantitative Messung von Rezeptordimeriserung und phosphorylationsabhängige Kopplung an Interaktionspartner wurden Protein-Komplementations-Assays der TEV Protease, split-TEV Assays, verwendet. Hierzu wurde jeder Assay an eindeutige EXT-Reporter gekoppelt. Zusätzlich wurde die Aktivierung von 30 verschiedenen EXT-gekoppelten cis-regulatorischen Elementen erfaßt, um so einen Einblick in die nachfolgende Aspekte der Signalverarbeitung zu erhalten. Alle Assays wurden mit eindeutigen EXTs durchgeführt und mittels Microarray analysiert. Die simultane Analyse dreier verschiedener und regulierter Rezeptor Komplexe (ErbB2/2, 2/3, 2/4) zeigte, dass EXT-basierte Assays geeignet sind rezeptor-spezifische Signalereignisse zu unterscheiden. EXTassays sind daher geeignet quantitative Profile aktivierter Signalkaskaden in Zellen erstellen zu können.
Schlagwörter: ERBB; Microarray; Signalübertragung; Hochdurchsatz; Reporter Gen; cis-element; TEV
