Functional and mechanistic characterization of the F-box protein Fbxw5

Abstract

Regulierte Ubiquitylierung von Proteinen in Eukaryoten wird häufig durch Cullin-RING-Ubiquitin Ligasen (CRLs), der größten Familie der Ubiquitin E3 Ligasen, vermittelt. CRLs sind durch einen modularen Aufbau aus einem katalytischen Kernkomplex und einem Substratspezifitätsmodul charakterisiert. Während der katalytischen Kernkomplex aus einem Cullin sowie einem RING-Domänen enthaltenden Protein besteht, unterteilt sich das Substratspezifitätsmodul üblicherweise in ein Verknüpfungs- und ein Substraterkennungsprotein. Die Kombination unterschiedlicher Substratspezifitätsmodule mit dem katalytischen Kernkomplex ermöglicht die Bildung verschiedener CRL-Komplexe, die jeweils unterschiedliche Gruppen von Substraten erkennen können. Das bisher wenig untersuchte F-box und WD40-Domänen-entahltende Protein Fbxw5 stellt ein besonderes Substraterkennungsprotein dar, da es potentiell in der Lage ist, in zwei unterschiedliche CRL-Komplexe zu assemblieren: mittels seiner F-box-Domäne in Cul1-basierte (SCF) Komplexe und durch seine putativen DWD-Boxen in Cul4A-basierte (CRL4) Komplexe. Hierbei war bisher unklar, ob Fbxw5 in vivo tatsächlich in aktive SCF Komplexe integriert. In der vorliegenden Studie zeigen wir, dass ektopisch exprimiertes und endogenes Fbxw5 vorwiegend in SCF Komplexe assembliert und wir identifizieren das Epidermale Wachstumsfaktor-Rezeptor Kinase Substrat 8 (Eps8) als erstes Substrat für SCFFbxw5. Eps8 ist ein bifunktioneller Regulator des Aktinzytoskeletts, der im Falle von erhöhten Proteinspiegeln zu vermehrter Invasion und Migration in manchen Krebszellen beiträgt. Fbxw5 interagiert mit endogenem Eps8, in vitro rekonstituiertes SCFFbxw5 ubiquityliert Eps8 und siRNA-vermittelte Herunterregulation von Fbxw5 in HeLa Zellen führt zum Anstieg von Eps8 Proteinspiegeln, was auf SCFFbxw5-abhängige Degradation von Eps8 in vivo hinweist. Darüber hinaus identifizieren wir Nek9, bekannt als mitotische Kinase und Autophagie-Regulator, als spezifischen, endogenem Interaktionspartner von Fbxw5 und Eps8. Nek9 phosphoryliert Eps8 an mehreren Aminosäurepositionen in vitro, was interessanterweise zur Inhibierung von SCFFbxw5-vermittelter Eps8-Ubiquitylierung führt. Damit konsistent führt ektopische Expression einer konstitutiv aktiven Form von Nek9 zum Anstieg von Eps8 Proteinspiegeln in Zellen. Zusammengenommen mit bereits publizierten Studien zeigen diese Ergebnisse, dass Fbxw5 in zwei unterschiedlichen CRL-Komplexen fungieren kann und dass Fbxw5 im Kontext eines SCF Komplexes Eps8 Degradation in Zellen vermittelt. Des Weiteren deuten sie darauf hin, dass SCFFbxw5-abhängige Ubiquitylierung von Eps8 einer eher unerwarteten, negativen Regulation durch Phosphorylierung unterliegt.