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dc.contributor.advisor Jahn, Reinhard Prof. Dr. de
dc.contributor.author Hernandez, Javier Matias de
dc.date.accessioned 2012-03-20T06:55:11Z de
dc.date.accessioned 2013-01-18T14:23:11Z de
dc.date.available 2013-01-30T23:51:08Z de
dc.date.issued 2012-03-20 de
dc.identifier.uri http://hdl.handle.net/11858/00-1735-0000-0006-B5DF-A de
dc.description.abstract Um mechanistische Einblicke in die SNARE-vermittelte Fusion von Membranen zu gewinnen, wurde ein neues Modelsystem etabliert und charakterisiert. Hierfür wurden SNARE-Proteine unter Verwendung von Octyl-ß-D-Glucosid (OG) in große Liposomen rekonstituiert und die Größe der Liposomen, Orientierung der Proteine und die Insertionseffizienz analysiert. Es konnten SNARE-Liposomen mit guten Rekonstitutionseigenschaften hergestellt werden, die sich in einer Größenordnung von 100 nm befanden. Um eine verhältnismäßig schnelle Mischung von Lipiden zu erreichen und eine substantielle Zunahme der Liposomengröße beobachten zu können, musste der 1:1 Syntaxin-SNAP-25 Akzeptorkomplex mit einem C-terminalen Synaptobrevin-Fragment (ΔN syb) stabilisiert werden. Dieses Synaptobrevin-Fragment dient als Nukleierungsstelle und ermöglicht damit eine schnelle Bildung des trans-SNARE-Komplexes. Es stellte sich heraus, dass der Austausch von ΔN Synaptobrevin am Syntaxin-SNAP-25-Akzeptor komplex den limitierenden Schritt bei der Lipidmischungskinetik darstellte, der zu einem beständigen Docking-Übergangszustand führte, der sich kinetisch von der Membranfusion unterscheiden ließ. Die Fähigkeit von ΔN Synaptobrevin die Bildung des vollständigen SNARE-Komplexes hinauszuzögern und zu verlangsamen wurde hier genutzt, um mutmaßliche Fusionsintermediate erfassen zu können. Dies führte zu der ultrastrukturellen Identifizierung von hemi-fusionierten Liposomen mit einer erweiterten Kontaktmembran und einem gedockten Intermediat, das eine kompakte Interaktionsfläche zwischen den Lipid-Doppelschichten aufwies. Unter die Verwendung eines bulk assays war es möglich die Lipidmischung zwischen den inneren Membranschichten von der Lipidmischung zwischen den äußeren Membranschichten zu unterscheiden und dadurch konnte gezeigt werden, dass Hemifusion in dem vorliegenden System ein alternativer Endzustand zur vollständigen Fusion darstellt.Das Kontaktintermediat zwischen den Lipiddoppelschichten konnte durch die Einführung einer deletierten Mutante von Synaptobrevin (Δ 84), die die +8-Schicht des SNARE-Komplexes unterbricht, arretiert werden. Dies deutet darauf hin, dass für die Membranfusion eine einwandfreie mechanische Transduktion des SNARE-Komplexes zu den Transmembrandomänen benötigt wird. Desweiteren konnte die Δ 84-Mutante keine Hemifusion erzeugen, was darauf schließen lässt, dass Hemifusion ein alternativer Prozess zur vollständigen Fusion ist, der nach dem Kontakt der Lipid-Doppelschichten erfolgt. Δ 84-Synaptobrevin konnte jedoch die Fusion von zwei kleinen Liposomen vermitteln. Dies zeigt, dass die Krümmung der Membran in der SNARE-vermittelte Fusion eine Rolle spielt und kann mit dem Stalk-Mechanismus der Membranfusion übereinstimmend gedeutet werden. Basierend auf diesen Erkenntnissen und der Fähigkeit mögliche Fusionsintermediate zu verlangsamen und zu arretieren, wurde ein Reaktionsmechanismus für die SNARE-vermittelte Membranfusion aufgestellt. de
dc.format.mimetype application/pdf de
dc.language.iso eng de
dc.rights.uri http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/ de
dc.title Reconstituted SNARE-mediated fusion: towards a mechanistic understanding de
dc.type doctoralThesis de
dc.title.translated Rekonstitution SNARE-vermittelter Fusion: zum besseren Verständnis des Mechanismus de
dc.contributor.referee Jahn, Reinhard Prof. Dr. de
dc.date.examination 2011-03-28 de
dc.subject.dnb 500 Naturwissenschaften de
dc.description.abstracteng A novel and well-characterized model system has been developed and used in order to extract mechanistic insights on the SNARE-mediated fusion process. The reconstitution of SNAREs onto large liposomes mediated by n-octyl-β-D-glucoside (OG) was characterized according to size, protein orientation and insertion efficiency. This resulted in SNARE-liposomes with good reconstitution properties that were in the 100 nm range. To induce relatively fast lipid-mixing and observe substantial size increments, it was found essential to stabilize a 1:1 syntaxin⋅SNAP-25 acceptor complex with a C-terminal synaptobrevin fragment (denoted ΔN syb), which provided a fast nucleation site for trans SNARE complex formation. The kinetics of lipid-mixing was found to be governed by the displacement of ΔN syb from the syntaxin⋅SNAP-25 acceptor complex, which gave rise to a transient but long-lived docking state which could be kinetically resolved from fusion. The ability for ΔN syb to delay and slow-down N to C-terminal nucleation, or zippering, was exploited to capture and arrest putative fusion intermediates. This lead to the ultrastructural identification of hemifused liposomes exhibiting extended diaphragms and also to a docked intermediate that consisted of a tight bilayer-bilayer contact interaction. Using a bulk assay to discriminate inner leaflet lipid mixing from outer leaflet lipid-mixing it was possible to conclude that hemifusion in this system constitutes an alternative end-state to fusion.The bilayer-bilayer contact state could be arrested by introducing a deletion mutation on synaptobrevin (Δ84) which interrupted the +8 layer of the SNARE complex, suggesting that a SNARE complex requires efficient mechanical transduction from the SNARE complex to the transmembrane domains in order to mediate fusion. Furthermore, the mutant could not mediate hemifusion, suggesting hemifusion side tracked from fusion at a step posterior to bilayer-bilayer contact. However, Δ84 synaptobrevin was found to mediate fusion between two small liposomes, revealing that curvature stress does play a role in SNARE-mediated fusion and was interpreted as being consistent with the stalk mechanism of membrane fusion. Based on these findings and on the ability to slow down and arrest putative fusion intermediates, a SNARE-mediated fusion reaction pathway was proposed. de
dc.contributor.coReferee Steinem, Claudia Prof. Dr. de
dc.contributor.thirdReferee Wahl, Markus Prof. Dr. de
dc.subject.topic Göttingen Graduate School for Neurosciences and Molecular Biosciences (GGNB) de
dc.subject.ger SNARE de
dc.subject.ger Membranfusion de
dc.subject.eng SNARE de
dc.subject.eng membrane fusion de
dc.subject.bk Biologie de
dc.identifier.urn urn:nbn:de:gbv:7-webdoc-3439-1 de
dc.identifier.purl webdoc-3439 de
dc.affiliation.institute Göttinger Graduiertenschule für Neurowissenschaften und molekulare Biowissenschaften (GGNB) de
dc.subject.gokfull Biologie de
dc.identifier.ppn 719867606 de

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