Mikroautophagischer Abbau von Teilen der Kernhülle und Untersuchungen zum Transport und der Aktivität von Atg15p in der Hefe Saccharomyces <i>cerevisiae</i>

Abstract

Autophagie ermöglicht eukaryotischen Zellen ein Überleben bei Nährstoffmangel. Der Abbau von Teilen des Zellkerns und der Kernmembran (ER) durch PMN (piecemeal microautophagy of the nucleus) ist ein mikroautophagischer Prozess. Ausgehend von Kontaktstellen zwischen der Vakuolenmembran und dem endoplasmatischen Retikulum um den Zellkern kommt es bei PMN zur Invagination der Vakuolenmembran, welche die sich bildenden ER-Vesikel einhüllt. Anschließend erfolgt die Lyse der gebildeten Vesikel im Innern der Vakuole. Diese Arbeit zeigt erstmals anhand von Untersuchungen mit dem Markerprotein GFP-Osh1p, dass es sich bei PMN um eine spezielle Form der Mikroautophagie handelt und anders als seither angenommen nahezu alle der zum jetzigen Zeitpunkt bekannten Autophagie-Proteine an PMN beteiligt sind. Die meisten dieser Proteine können zumindest vorübergehend an der präautophagosomalen Struktur (PAS) lokalisiert werden. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass auch einzelne der speziell für den Cvt-Weg notwendigen Proteine für den spezifischen Abbau von Teilen des Zellkerns durch PMN essentiell sind. An PMN sind darüber hinaus einige Proteine der Vakuolenfusion beteiligt.Das Protein Atg15p ist an der vakuolären Lyse von autophagischen Vesikeln beteiligt. In dieser Arbeit wurden N- sowie C-terminale GFP-Fusionen von Atg15p erzeugt. Die Fusionsproteine ermöglichen eine direkte Lokalisierung des Atg15p. Die Erzeugung C-terminal verkürzter Versionen ermöglichte Hinweise auf die an der katalytischen Triade beteiligten Aminosäuren. Es wurde eine Chimäre erzeugt, die an der vakuolären Membran lokalisiert ist (ALP-Atg15p). Das Konstrukt zeigt, dass das Serin für die lytische Aktivität von Atg15p essentiell ist.Der Transport von Atg15p und dem Protein Sna3p über den MVB-Weg erfolgt Ubiquitin-unabhängig. Sna3p kann jedoch durch die Ubiquitin-Ligase Rsp5p ubiquitiniert werden, für die Interaktion ist ein PxY-Motiv notwendig. Diese Ubiquitin-Konjugation steigert die Transport-Effizienz von Sna3p zu MVB Vesikeln. Das Motiv findet sich auch in Atg15p. Die in dieser Arbeit durchgeführte Mutagenese des Motivs lieferte erste Hinweise auf dessen Funktion für die Sortierung von Atg15p.