Regulation of rat Liver Glucokinase Gene Expression by Sterol Regulatory Element Binding Protein-1a and Forkhead box classO1 Transcription factors

Abstract

Die Glucokinase (GK), auch Hexokinase-IV, katalysiert die Phosphorylierung von Glucose zu Glucose-6-phosphat. Im Gengensatz zu anderen Hexokinasen hat die GK eine geringe Affinität für Glucose, wird durch das Reaktionsprodukt nicht gehemmt und weist eine sigmoidale Kinetik auf, obwohl sie als Monomer vorliegt. Defekte im GK-Gen führen zum maturity-onset diabetes of the young type-2 (Insulin-unabhängig [MODY-2]). So spielt die GK eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung der Glucose-Homeostase. Die GK wird vorwiegend in Leber-Hepatozyten, β-Zellen des Pankreas und in einigen neuroendokrinen Zellen des Gastrolintestinaltrakts und des Gehirns exprimiert. In Hepatozyten sind hauptsächlich Insulin und Glucagon für die Regulation der GK-Expression verantwortlich. Hierbei agiert Insulin vorwiegend über den PI3K/PKB-signalweg und moduliert die Aktivität verschiedener Transkriptionsfaktoren, wie z.B. dem Sterol regulatory element binding protein-1 (SREBP-1) und den FoxO/forkhead Transkriptionsfaktoren. Neuere Veröffentlichungen deuten darauf hin, dass sowohl SREBP-1 als auch FoxO1 in antagonistischer Weise die GK-Expression und somit den Glucose-/Lipid-Metabolismus in der Leber beeinflussen. Die genauen Details der SREBP-1 und FoxO1-regulierten GK-Genexpression sind allerdings noch nicht bekannt. Das Ziel dieser Arbeit war daher die Untersuchung der Insulin-abhängigen SREBP-1 und FoxO1- vermittelten Expression des GK-Gens in primären Rattenhepatozyten und in den Hepatomazellen HepG2. Die Stimulation von primaren Rattenhepatozyten mit Insulin induzierte die Expression von GK und SREBP-1. Auch konnte SREBP-1 durch eine Behandlung mit dem LXR-Agonisten TO-901317 induziert werden, was wiederum zu einer Induktion der GK-mRNA Spiegel führte. Computer-Analysen des Leber-spezifischen GK-Promotors zeigten 3 putative SREBP-1 Bindungsstellen (SREs) auf. Transfektionsversuche mit Luciferasegen-Konstrukten, welche durch seriell deletierte GK-Promotoren reguliert werden, deuteten darauf hin, dass eine Sequenz, bekannt als Footprint-B-Seite, in die SREBP-1-abhängige Regulation involviert ist. Weitere Analysen der Footprint-B-Seite, welche in Abschnitt 1 und Abschnitt 2 unterteilt werden kann, zeigten, dass vor allem Abschnitt 2 und weniger Abschnitt 1 für den SREBP-1 Effekt notwendig ist. Des Weiteren konnten durch Mutationsanalysen des GK-Promotors zwei andere Sequenzen, SRE2 und SRE3, identifiziert werden. Transfektionsversuche in primären Hepatozyten und in HepG2-Zellen implizieren, dass diese Elemente Zell-spezifisch verwendet werden. Während in primären Hepatozyten sowohl SRE2 als auch SRE3 für die SREBP-1 vermittelte GK-Promotoraktivität wichtig sind, trägt in HepG2-Zellen nur SRE2 zum SREBP-1-Effekt bei. Zudem ging die SREBP-1-vermittelte Aktivierung des GK-Promotors durch Mutation des HNF-4-Bindungselements verloren, was darauf hindeutet, dass für die vollständige Induktion der GK-Genexpression durch SREBP-1 eine Interaktion dieser Transkriptionsfaktoren notwendig ist. Insulin hat einen dynamischen Effekt auf die FoxO-Transkriptionsfaktoren, welche durch eine PKB-abhängige Phosphorylierung in eine inaktive Form überführt werden und so aus dem Kern ausgeschlossen werden. Hepatozyten, welche mit FoxO1-Expressionsvektoren transfiziert wurden, regulierten ihre GK-mRNA und GK-Promotoraktivität herab. Diese Repression ging durch Stimulation der Hepatozyten mit Insulin verloren. Bekamen Ratten für 48h kein Futter, so war das GK-Protein kaum detektierbar, allerdings war der FoxO1 Proteinspiegel erhöht. Es ist bekannt, dass die transkriptionelle Aktivität der FoxO-Proteine neben Insulin auch durch NAD+ abhängige SIRT1 Deacetylierung reguliert wird. Resveratrol reguliert die mRNA- und Proteinspiegel der GK herab und kehrt den induzierenden Effekt von Insulin um. Ähnliche Resultate wurden für die GK-Enzymaktivität beobachtet. Computer-Analysen des GK-Promotors prognostizierten zwei FoxO1-Bindungselemente (FBEa und FBEb). Überexpression von FoxO1 vermindert die GK-Promotoraktivität in primaren Hepatozyten und in HepG2-Zellen. Mutationen im FoxO1-Bindungselement FBEb beseitigen die FoxO1 vermittelte Repression des GK-Promotors. Des Weiteren führt die Behandlung von Hepatozyten mit dem SIRT1-Aktivator Resveratrol zur Deacetylierung und Aktivierung von FoxO1. Interessanter Weise ging der FoxO1-Effekt auch verloren, wenn die HNF4-Bindungsstelle mutiert war. Dies suggerierte, das FoxO1 mit HNF-4 interagiert und dessen Aktivität reguliert. Insgesamt zeigt die Studie, dass SREBP-1 die GK-Genexpression über die Footprint-B2-Seite, SRE2 und über Interaktion mit HNF-4 aktivieren kann. Obwohl die Interaktion mit HNF-4 auch für die FoxO1-abhängige Regulation des GK- Promotor wichtig ist, konnten zwei zusätzliche Bindungsstellen identifiziert werden. Zum ersten Mal konnte gezeigt weden, dass die FoxO1-Aktivität durch Resveratrol und SIRT1 reguliert wird und dass die Resveratrol-vermittelte Reduktion der GK-Expression auf einer Bindung von FoxO1 am Bindungselement oder auf einer Interaktion mit HNF-4 beruht.