NEW COMPUTATIONAL METHODS FOR 3D STRUCTURE DETERMINATION OF MACROMOLECULAR COMPLEXES BY SINGLE PARTICLE CRYO-ELECTRON MICROSCOPY

Abstract

In der kryoelektronenmikroskopischen Einzelpartikelrekonstruktionsmethode werden Projektionsbilder vieler in erster Ordnung identischer Kopien des zu untersuchenden makromolekularen Komplexes kombiniert, um dessen dreidimensionale Struktur zu berechnen. Dazu werden die zu untersuchenden Partikeln in hydriertem Zustand in vielen zufälligen Orientierungen in einer dünnen Schicht vitrifizierten, nicht kristallinen Eises eingebettet und mittels eines Transmissionselektronenmikroskopes abgebildet, wobei Projektionsbilder aufgezeichnet werden, die vielen verschiedenen Projektionsrichtungen einer angenommenen zugrunde liegenden gemeinsamen identischen Struktur aller Partikel entsprechen. Die tatsächliche strukturelle Heterogenität der analysierten Partikel, resultierend aus der Koexistenz verschiedener Konformationen oder verschiedener Liganden-Bindungszustände, gilt es zu identifizieren, da die erreichbare Auflösung und Korrektheit berechneter Strukturen ansonsten durch fälschliche Mittelung über verschiedene Zustände limitiert sind. Die Kryoelektronenmikroskopische Einzelpartikelrekonstruktionsmethode ist keine Ensemble-Technik und somit die Methode der Wahl, um die Struktur insbesondere großer makromolekularer Komplexe, die sich nur schwer in der für Röntgenkristallographische Analysen nötigen Qualität und Quantität auf reinigen lassen, zu bestimmen. Durch die Analyse der aufgenommenen Projektionsbilder individueller makromolekularer Komplexe können strukturelle Variationen innerhalb einer Probe potentiell identifiziert werden, sobald der aufgenommene Datensatz durch entsprechende Bildverarbeitungstechniken in Subpopulationen aufgeteilt wird, die individuellen konformationellen Zuständen entsprechen. In der Strukturbestimmung makromolekularer Komplexe mit einem hohen Grad an struktureller Dynamik ist die Identifizierung verschiedener Konformationen eine Herausforderung, da bei der Prozessierung für jedes stark verrauschte individuelle Einzelpartikelbild zusätzlich zu einem unbekannten konformellen Zustand drei trans lationale und drei Freiheitsgrade der Rotation berücksichtigt werden müssen. In der klassischen Random Conical Tilt Rekonstruktion werden die durch die Aufnahme von Projektionsbildpaaren bei unterschiedlich gekipptem Probenhalter zusätzlich gewonnenen experimentellen Informationen ausgenutzt, um Startmodelle zu berechnen, die jedoch durch die Berechnung aus einer limitierten Anzahl von Projektionsbildern und eine unvollständige Abdeckung aller Projektionsrichtungen nur eine begrenzte Qualität und Auflösung haben. Basierend auf der Verfügbarkeit von qualitativ hochwertigen Projektionsbildpaaren, aufgenommen bei verschieden orientierter Probe, wobei die Projektionsbilder beider Orientierungen unabhängig klassifiziert wurden, wird eine neue Methode vorgestellt, die diese doppelt klassifizierten Projektionsbildpaare ausnutzt, um Startmodelle aus einer stark erhöhten Anzahl von Projektionsbildern und Projektionsrichtungen zu errechnen, wobei die Qualität der erhaltenen Modelle gegenüber klassischen Methoden stark verbessert und die Auftrennung der Modelle nach unterschiedlichen zu Grunde liegenden konformellen Zuständen nun möglich ist. Die neue Strategie zielt darauf ab, konformelle Diversität und dynamische Zustände auf dreidimensionaler Ebene zu untersuchen. Die für die neue Strategie benötigten gesteigerten Anforderungen bezüglich der benötigten Computer Rechenleistung, resultierend aus der erhöhten Anzahl zu prozessierender Einzelbider, werden analysiert und eine Strategie zur Steigerung der Rechenleistung, basierend auf neusten Errungenschaften der Informationstechnik, wird präsentiert, die Anwendungen und Analysen ermöglicht, die noch vor kurzem unmöglich erschienen.