Deneddylation and fungal development - Regulation of Nedd8 protein modification by DenA and the COP9 signalosome
Deneddylierung und pilzliche Entwicklung - Regulierung von Nedd8 Proteinmodifizierung durch DenA und das COP9 Signalosom
by Martin Christmann
Date of Examination:2011-12-09
Date of issue:2012-08-16
Advisor:Prof. Dr. Gerhard Braus
Referee:Prof. Dr. Gerhard Braus
Referee:Prof. Dr. Ralf Ficner
Referee:Prof. Dr. Peter Rehling
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Abstract
English
Ubiquitin dependent protein degradation is a common principle in eukaryotic organisms to control appropriate temporal and spatial protein levels. Abnormal regulation leads to embryonic lethality in plants, insects and mammals and is responsible for the development of certain types of cancer in humans. Substrate specificity of degradation is mediated by E3-ubiquitin ligases, of which most contain a cullin as the core component. Cullin containing ligases are regulated by covalent modification with the ubiquitin-like protein Nedd8. The COP9 signalosome (CSN) and the deneddylating protein 1 (DEN1) are two abundant deneddylases capable of removing Nedd8 from CRLs. This study employs the fungal model organism Aspergillus nidulans to explore the function of deneddylation for development. (i) The homolog of DEN1 in the fungus, DenA, was identified and the developmental function was investigated. Genetic experiments revealed a crucial function of denA for the promotion of asexual development and the repression of sexual fruit body formation in the presence of light. Biochemical studies, as well as molecular and genetic analysis clearly indicate a deneddylase activity of DenA. Double deletion of denA and csnE results in a strain that can only grow vegetative. Impairment of asexual as well as sexual development in the double knock-out suggests that some developmental functions are shared between the two deneddylases. Both, denA and csnE deletion strains display distinct phenotypic characteristics, but overlap in their inability to inhibit the initiation of sexual development in light. This converges in a physical interaction between DenA and the CSN complex that is presumably involved in controlling the balance between the two deneddylases on the protein level. The results indicate a crucial function of deneddylation for the coordination of fungal development. This requires distinct functions of DenA in terms of asexual spore formation and of CSN to proceed beyond the primordial stage of sexual development. Orchestrated function of both deneddylases is required for the light-dependent inhibition of sexual fruit body formation. (ii) Furthermore the CSN complex was studied with regard to the dynamics of complex formation in vivo. Functional, tagged versions of CsnA and CsnD were explored for their ability to recruit the remaining subunits of the CSN in co-purification experiments. CsnA recruited six additional subunits in most experiments, but failed to pull-down the catalytic active subunit CsnE. CsnD co-purified with all other seven subunits when expressed in the wild type background. Deletion of csnG in the corresponding strain completely abolished the ability of CsnD to recruit any of the additional CSN subunits. These data suggest that the fungal CSN exists primarily as holo-complex, whereas sub-complexes are hardly maintained in vivo.
Keywords: Aspergillus nidulans; deneddylase; Nedd8; CSN; DenA; DEN1; ubiquitin; Ubl; cullin
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Der Abbau von Proteinen durch das
Ubiquitin-Proteasome System ist ein Mechanismus mit zentraler
Bedeutung für die korrekte Steuerung unterschiedlicher zelluläre
Prozesse. Fehlregulation führt bei Pflanzen, Insekten und
Säugetieren bereits im Embryonalstadium zum Absterben des
Organismus und ist an der Entstehung einiger Formen von Krebs
beteiligt. Die spezifische Markierung von Zielproteinen mit
Ubiquitin benötigt die Aktivität von E3-Ligasen. Die größte Gruppe
dieser Enzyme enthält ein Cullin als zentrales Element. Diese Art
von Ligasen wird in ihrer Aktivität und Stabilität durch das
kleine, Ubiquitin-ähnliche Protein Nedd8 reguliert. Das COP9
Signalosome (CSN) und die humane Deneddylase 1 (DEN1) sind die
häufigsten Proteasen, die diese Modifikation rückgängig machen. In
dieser Arbeit wurde die Rolle der beiden Deneddylasen für die
Entwicklung des filamentösen Pilzes Aspergillus nidulans
untersucht. (i) Das homologe Protein zu humanem DEN1 im Pilz, DenA,
konnte identifiziert werden und seine Rolle für die
Fruchtkörperbildung wurde untersucht. DenA spielt eine wichtige
Rolle bei der lichtabhängigen Förderung asexueller Entwicklung und
bei der Repremierung der sexuellen Fruchtkörperbildung im Licht.
Genetische Studien, sowie Ergebnisse aus biochemischen und
molekularen Experimenten zeigen deutlich das DenA
Deneddylaseaktivität besitzt. Deletiert man beide Deneddylasen,
csnE und denA, ist der entsprechende Stamm zu keiner
Fruchtkörperbildung mehr fähig, wächst jedoch noch vegetativ, was
auf eine teilweise Funktionsüberschneidung zwischen beiden
Proteasen hinweist. Beide Einzelmutanten zeigen spezifische
Phänotypen, aber gleichen sich in der Eigenschaft, die Initiierung
sexueller Entwicklung im Licht nicht mehr unterdrücken zu können.
Diese Verbindung zeigt sich auch in Form einer physischen
Interaktion zwischen dem CSN Komplex und DenA welche möglicherweise
dazu dient die Balance zwischen beiden Proteasen zu kontrollieren.
Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen das Deneddylierung eine
wichtige Rolle bei der Koordinierung von Entwicklung im Pilz
spielt. DenA beeinflusst vorrangig die asexuelle Sporenbildung,
während das CSN für die sexuelle Fruchtkörperentwicklung wichtig
ist. Beide Deneddylasen beeinflussen die Lichtregulation der
sexuellen Entwicklung. (ii) Der CSN Komplex wurde hinsichtlich der
Dynamik des Zusammenbaus untersucht. Hierzu wurden
Aufreinigungsexperimente mit modifizierten, funktionellen Versionen
der Untereinheiten CsnA und CsnD durchgeführt. In Aufreinigungen
mit CsnA konnten die meisten CSN Untereinheiten identifiziert
werden, mit Ausnahme der enzymatisch aktiven Untereinheit CsnE.
CsnD interagierte, ohne Ausnahme, mit allen anderen CSN
Untereinheiten, verlor diese Interaktion jedoch komplett nachdem
csnG im entsprechenden Stamm deletiert wurde. Dies lässt vermuten,
dass das CSN im Pilz primär als Gesamtkomplex vorliegt, während
kleinere Unterkomplexe in der Zelle nicht stabil sind.
Schlagwörter: Aspergillus nidulans; Deneddylase; Nedd8; CSN; DenA; DEN1; Ubiquitin; Ubl; Cullin