Optimierung der molekularbiologischen Diagnostik systemischer Mykosen

Optimization of the molecular diagnosis of systemic mycoses

by Rolf Christian Schettler
Doctoral thesis
Date of Examination:2012-06-04
Date of issue:2012-05-15
Advisor:Prof. Dr. Uwe Groß
Referee:Prof. Dr. Uwe Groß
Referee:PD Dr. Manfred Weidmann
Persistent Address: http://dx.doi.org/10.53846/goediss-1523

 

 

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Abstract

English

The rapid and efficient diagnosis of systemic fungal infections is essential for an effective therapeutic regimen of frequent immunosuppressed patient population. For this purpose, the PCR method offers a good diagnostic approach. The difficulty, however, is the most sensitive DNA isolation, including various methods have been published. In this study we compared six different DNA processing protocols for Candida albicans, Aspergillus fumigatus, and Saccharomyces cerevisiae under in vitro conditions in terms of speed and sensitivity. It was found that the combination of enzymatic lysis and thermal rupture is most time consuming towards to the purely thermal, purely enzymatic or purely mechanical method of DNA isolation but provides the most sensitive results. The subsequent comparison of three different PCR protocols showed a significantly improved time efficiency of real-time PCR technique coupled with higher sensitivity compared to conventional PCR and nested PCR. Thus, the combination of enzymatic-thermal DNA isolation with the use of RT-PCR technique is the most efficient and most sensitive method of detection of human pathogenic fungal species.
Keywords: Candida albicans; Aspergillus fumigatus; Saccharomyces cerevisiae; PCR; Real-Time-PCR; RT-PCR; Nested-PCR

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Die schnelle und effiziente Diagnostik systemischer Mykosen ist essentiell für ein effektives Therapieregime des häufig immunsupprimierten Patientenkollektivs. Hierfür bietet das Verfahren der PCR einen guten diagnostischen Ansatz. Die Schwierigkeit besteht jedoch in der möglichst sensitiven DNA-Isolation, wozu unterschiedliche Verfahren publiziert wurden. In dieser Arbeit wurden sechs unterschiedliche DNA- Aufarbeitungsprotokolle für Candida albicans, Aspergillus fumigatus und Saccharomyces cerevisiae unter in-vitro-Bedingungen bzgl. Zeitbedarf und Sensitivität mineinander verglichen. Es zeigte sich, dass die Kombination aus enzymatischer Lyse und thermischer Ruptur zwar den höchsten Zeitbedarf gegenüber der rein thermischen, rein enzymatischen bzw. rein mechanischen Verfahren bei der DNA-Isolation hat, gleichzeitig jedoch die sensitivsten Ergebnisse liefert. Anschließend ergab ein Vergleich von drei unterschiedlichen PCR-Protokollen eine deutlich verbesserte Zeiteffizienz der real-time-PCR-Technik bei gleichzeitig höherer Sensitivität gegenüber der konventionellen PCR bzw. Nested-PCR. Die Kombination aus enzymatisch-thermischer DNA-Isolation mit Anwendung der RT-PCR-Technik stellt somit die effizienteste und sensitivste Nachweismethode humanpathogener Pilzspezies dar.
Schlagwörter: Candida albicans; Aspergillus fumigatus; Saccharomyces cerevisiae; PCR; Real-Time-PCR; RT-PCR; Nested-PCR
 
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