Show simple item record

Development of Fluorescence Activated Synaptosome Sorting (FASS) and analysis of VGLUT1 synapses from mouse brain

dc.contributor.advisorHerzog, Etienne Dr.de
dc.contributor.authorBiesemann, Christophde
dc.date.accessioned2012-10-05T18:36:16Zde
dc.date.accessioned2013-01-18T14:23:15Zde
dc.date.available2013-01-30T23:50:18Zde
dc.date.issued2012-10-05de
dc.identifier.urihttp://hdl.handle.net/11858/00-1735-0000-000D-F0C0-Cde
dc.identifier.urihttp://dx.doi.org/10.53846/goediss-3185
dc.description.abstractIm Gehirn werden Signale zwischen Nervenzellen an chemischen Synapsen übermittelt. Ob eine Synapse dabei erregende, hemmende oder modulatorische Signale überträgt, hängt von den beteiligten Neurotransmittern und deren Neurotransmitter-Rezeptoren ab. Um die physiologische Funktion dieser unterschiedlichen synaptischen Subtypen und deren Beteiligung an pathologischen Prozessen im Gehirn zu untersuchen, ist die detaillierte Kenntnis ihrer biochemischen Zusammensetzung eine notwendige Vorraussetzung. Um die Proteinzusammensetzung und Funktion von Synapsen zu erforschen, fanden in den letzten Jahrzehnten Synaptosomenpräparationen breite Anwendung in der Wissenschaft. Als Synaptosomen bezeichnet man funktionelle synaptische Einheiten, die sowohl die Prä- als auch die Postsynapse enthalten und die seit 1960 routinemäßig mittels differentieller und Dichtegradientenzentrifugation aus Hirngewebe isoliert werden. Die Interpretation der von Synaptosomenpräparationen gewonnen Daten wird allerdings dadurch erschwert, dass die konventionelle Synaptosomenpräparation ein Gemisch von synaptischen Partikel aller synaptischen Subtypen enthält und durch einen beträchtlichen Anteil nicht-synaptischer Partikel, die von Glia und Neuronen stammen, verunreinigt ist. In der vorliegenden Arbeit habe ich zur weiteren Spezifizierung eine neue Methode entwickelt, welche die konventionelle Synaptosomenpräparation um die spezifische Selektion von fluoureszenten Synaptosomen mittels eines FACS-Gerätes erweitert. Hierbei diente eine vor kurzem in unserer Arbeitsgruppe entwickelte fluoreszente VGLUT1VENUS knock-in Mauslinie als Quelle fluoreszenter VGLUT1-Synapsen. Im Folgenden zeige ich, dass durch die von mir als „Flourescent Activated Synaptosome Sorting“ (FASS) bezeichnete Methode äußerst reine VGLUT1-Synaptosomen isoliert werden, die sowohl prä- als auch postsynaptische Bestandteile enthalten. Die weitere Untersuchung der FASS-aufgereinigten VGLUT1VENUS-Synaptosomen liefert Erkenntnisse über die synaptische Verteilung der Neuroligine und zeigt Unterschiede in der Verteilung von Glutamatrezeptoren zwischen synaptischen und extrasynaptischen Zonen. Eine Proteomanalyse zeigt die spezifische Anreicherung von 163 Proteinen in VGLUT1-Synapsen. Darunter sind viele bekannte synaptische Proteine, aber auch eine Vielzahl von Proteinen, für die noch keine Daten zur Lokalisation an VGLUT1-Synapsen vorliegen. Für drei dieser Proteine, nämlich FXYD6, Ly6H und TPD52, wird die Expression und Lokalisation an VGLUT1-Synapsen mit unabhängigen Methoden bestätigt. Zusammengenommen zeigt die vorliegende Arbeit, dass FASS ein neues und adäquates Verfahren für die Anreicherung von höchst reinem synaptischen Material ist, welches verwendet werden kann, um spezifische synaptische Subtypen in biochemischen, physiologischen oder pathophysiologischen Studien zu untersuchen.de
dc.format.mimetypeapplication/pdfde
dc.language.isoengde
dc.rights.urihttp://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/de
dc.titleDevelopment of Fluorescence Activated Synaptosome Sorting (FASS) and analysis of VGLUT1 synapses from mouse brainde
dc.typedoctoralThesisde
dc.title.translatedEntwicklung von „Fluorescence Activated Synaptosome Sorting“ (FASS) und die Analyse von VGLUT1-Synapsen des Mäusehirnsde
dc.contributor.refereeBrose, Nils Prof. Dr.de
dc.date.examination2010-11-11de
dc.subject.dnb570 Biowissenschaftende
dc.subject.dnbBiologiede
dc.subject.gokWXG 900de
dc.subject.gokWF 850de
dc.subject.gokWHC 700de
dc.description.abstractengSignal propagation between neurons in the brain is mediated by chemical synapses. Depending on the neurotransmitters and their receptors, synapses can transmit excitatory, inhibitory, or modulatory signals. A detailed knowledge about the biochemical composition of different subtypes of synapses is an essential requirement in order to study their function in physiology and pathology of the brain. Synaptosomes are functional nerve-terminals, including pre- and postsynapse, which have routinely been isolated from brain tissue by differential and density gradient centrifugation protocols since 1960. Synaptosome preparations have been utilized widely to analyze the function and protein composition of synapses for several decades. However, the interpretation of corresponding data is confounded by the fact that such synaptosome preparations contain many different types of synaptic particles as well as contaminations by non-synaptic particles from neurons and glia. In the present study, I established a new method, termed Fluorescence Activated Synaptosome Sorting (FASS), which extends traditional synaptosome preparations by selecting only fluorescent synapses using a cell sorter. A recently established fluorescent VGLUT1venus knock-in mouse line was used as a source of fluorescent VGLUT1 synaptosomes. I show here that FASS allows for the isolation of highly pure VGLUT1 synaptosomes containing pre- and post-synaptic elements. Further analysis of FASS purified VGLUT1venus synaptosomes provided insights into the synaptic distribution of neuroligins and into the distribution of glutamate receptors to synaptic and extrasynaptic sites. Using proteomic techniques I identified new proteins enriched at VGLUT1 synapses. For 3 of them (FXYD6, Ly6H and TPD52) I confirmed their expression and localization with independent methods. Taken together, this work shows that FASS is a powerful new tool to purify highly pure synaptic material which can serve to characterize synapses in biochemical, physiological and pathophysiological studies.de
dc.contributor.coRefereeKlopfenstein, Dieter Dr.de
dc.contributor.thirdRefereeJahn, Reinhard Prof. Dr.de
dc.subject.topicGöttingen Graduate School for Neurosciences and Molecular Biosciences (GGNB)de
dc.subject.gerVesikulärer Glutamattransporterde
dc.subject.gerVGLUTde
dc.subject.gerFluorescence Activated Synaptosome Sortingde
dc.subject.gerFASSde
dc.subject.gerFACSde
dc.subject.gerDurchflusszytometriede
dc.subject.gerSynaptosomde
dc.subject.gerProteomde
dc.subject.gerSubzelluläre Fraktionierungde
dc.subject.gerSynapsede
dc.subject.gerFXYD6de
dc.subject.gerTpd52de
dc.subject.engVesicular Glutamate Transporterde
dc.subject.engVGLUTde
dc.subject.engFluorescence Activated Synaptosome Sortingde
dc.subject.engFASSde
dc.subject.engFACSde
dc.subject.engflow cytometryde
dc.subject.engsynaptosomede
dc.subject.engproteomicsde
dc.subject.engsubcellular fractionationde
dc.subject.engsynapsede
dc.subject.engFXYD6de
dc.subject.engTpd52de
dc.subject.bk42.63de
dc.subject.bk42.15de
dc.identifier.urnurn:nbn:de:gbv:7-webdoc-3731-9de
dc.identifier.purlwebdoc-3731de
dc.affiliation.instituteGöttinger Graduiertenschule für Neurowissenschaften und Molekulare Biowissenschaften (GGNB)de
dc.identifier.ppn731461975de


Files in this item

Thumbnail

This item appears in the following Collection(s)

Show simple item record