Synaptic Ultrastructure and Regulation of Synaptic Transmission in Caenorhabditis elegans

Abstract

Die Exozytose von synaptischen Vesikeln wird durch das komplexe Proteinnetzwerk der aktiven Zone (AZ) zeitlich und räumlich streng reguliert. Im Elektronenmikroskop ist die präsynaptische AZ durch eine elektronendichte Struktur (engl.: dense projection, DP) in ihrem Zentrum charakterisiert, die in das Zytoplasma hineinragt. Diese DP ist von einer Wolke aus synaptischen Vesikeln umgeben und spielt vermutlich eine wichtige Rolle bei der Organisation und Regulation ihrer Freisetzung. Bisher ist unser Wissen über die molekulare Zusammensetzung der DP, ihren Aufbau und ihre 3D Ultrastruktur begrenzt. Die neuromuskuläre Synapse des Nematoden Caenorhabditis elegans ist ein einfaches Modellsystem um die Struktur und Funktion der AZ bei der synaptischen Informationsübertragung zu untersuchen. Unter Verwendung von Hochdruckgefrieren und Gefriersubstitution in Kombination mit Tomographie konnte ich zeigen, dass die DP der AZ in C. elegans stark strukturiert ist. In cholinergen und GABAergen neuromuskulären Synapsen sind die DPs verzweigt und bilden Ausbuchtungen in denen synaptische Vesikel oft in engem Kontakt mit der präsynaptischen Membran vorliegen. Diese Ausbuchtungen könnten spezifische Fusionsstellen für synaptische Vesikel darstellen. Große DPs der Neuron-Neuron-Synapsen scheinen Polymere der kleineren Strukturen in neuromuskulären Synapsen zu entsprechen. Ihr geometrischer Aufbau aus Verzweigungen und Ausbuchtungen ist sehr ähnlich und deutet darauf hin, dass den präsynaptischen DPs in C. elegans ein gemeinsames Bauprinzip zu Grunde liegt. Um besser zu verstehen, welche Mechanismen den Aufbau der Synapse steuern, haben wir die Morphologie von DPs in Mutanten untersucht, denen Proteine der AZ fehlen. Frühere Studien deuten darauf hin, dass das C. elegans-Homolog von Liprin-α, synapse defective 2 (SYD-2), eine Schlüsselrolle beim Aufbau von Synapsen und der Rekrutierung von synaptischen Proteinen zu entstehenden Synapsen spielt. Ich zeige hier, dass SYD-2 zusammen mit einem zweiten Protein der aktiven Zone (ELKS-1) die Größe der DPs an neuromuskulären Synapsen reguliert. Der Verlust von SYD-2 führt zu deutlich reduzierter Größe der DPs und ineffizienter Rekrutierung von synaptischen Vesikeln, während eine verstärkte Aktivität zur Bildung stark vergrößerter DPs führt. Allerdings findet diese Vergrößerung der DPs nur in der Anwesenheit von ELKS-1 statt. Das kürzlich beschriebene Protein RSY-1 ist ein negativer Regulator der Synapsenbildung und beeinträchtigt die Funktionalität von SYD-2. In dieser Studie liefere ich Belege dafür, dass RSY-1 als negativer Gegenspieler von SYD-2 agiert und damit die Größe der DPs festlegt. SYD-2/Liprin-α ist daher zusammen mit anderen Regulatoren für die dynamische Polymerisierung von DPs verantwortlich, nicht für die Synapsenbildung per se. Um besser zu verstehen, inwiefern axonaler Transport an der Synapsenbildung beteiligt ist, habe ich Mutanten von Motorproteinen analysiert, die in den Transport von synaptischen Proteinen involviert sind. Das Kinesin-3 UNC-104 wurde bereits als neuronenspezifisches anterogrades Motorprotein identifiziert, welches für den Transport von synaptischen und elektronendichten Vesikeln zur Synapse notwendig ist. Der Aktivitätsverlust von UNC-104 führt zur Ansammlung von Vesikeln im Zellkörper der Neurone. Um zu verstehen, ob und wie der defekte Transport die Bildung der aktiven Zone beeinträchtigt, habe ich C. elegans-Mutanten für unc-104 mittels Konfokalmikroskopie und Elektronenmikroskopie untersucht. Meine ersten Analysen weisen darauf hin, dass die Domäne, die Membranlipide binden kann, verantwortlich für den Kontakt zwischen UNC-104 und Vorläufern synaptischer und größerer elektronendichter Vesikel ist. Die Bildung von DPs in der aktiven Zone ist allerdings in UNC-104 Mutanten nur wenig betroffen. Dies weist darauf hin, dass Organellen, die mit Komponenten der aktiven Zone assoziiert sind, einen anderen Transportmechanismus nutzen. Zum ersten Mal zeige ich die Bildung ektopischer aber funktionaler Synapsen in den Zellkörpern von unc-104 Mutanten. Außerdem wurden die im Zellkörper akkumulierenden Vesikel als große elektronendichte Vesikel charakterisiert, die sich von elektronendichten Vesikeln an wildtypischen Synapsen unterscheiden. Wir vermuten, dass es sich bei diesen elektronendichten Vesikeln um Vorläufer der synaptischen Vesikel handelt, welche Proteine der synaptischen Vesikel zur aktiven Zone transportieren. Dort könnten reife synaptische Vesikel durch lokale Endozytose gebildet werden.