Molekulare Charakterisierung des murinen 66.3-kDa-Proteins

Abstract

Das murine 66.3-kDa-Protein wurde im Rahmen einer Proteomanalyse Mannose-6-Phosphat-bindender Proteine als eines von mehreren potentiell lysosomalen Matrixprotein identifiziert (Kollmann K, Mutenda KE, Balleininger M, Eckermann E, von Figura K, Schmidt B, Lübke T (2005) Identification of novel lysosomal matrix proteins by proteome analysis. Proteomics 5(15), 3966–3678). In der vorliegenden Arbeit gelang es, die lysosomale Lokalisation des endogenen 66.3-kDa-Proteins durch indirekte Immunfluoreszenz embryonaler Mausfibroblasten und durch subzelluläre Fraktionierung Tyloxapol-angereicherter Lysosomen aus Leberhomogenat nachzuweisen. Das 66.3-kDa-Protein wurde in HT1080-Zellen stabil exprimiert. Dort wird es durch limitierte Proteolyse aus einer Proform von 75kDa in ein N-terminales 28-kDa-Fragment und ein C terminales 40-kDa-Fragment und anschließend aus letzterem in ein C terminales 15-kDa-Fragment prozessiert. Das 28-kDa- und das 15-kDa-Fragment konnten intralysosomal nachgewiesen werden. Im Northern Blot konnte ein hoher Transkriptionslevel in Lunge und Hoden und im Westernblot eine hohe Proteinexpression in Gehirn, Lunge, Milz und Herz detektiert werden. Interessanterweise wird das endogene murine 66.3-kDa Protein höchst gewebespezifisch in aktive Fragmente prozessiert. Eine mögliche Funktion des Proteins wurde durch Affinitätschromatographie und durch Interaktionsstudien untersucht.