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Molekulare Charakterisierung des murinen 66.3-kDa-Proteins

Molecular characterization of the murine 66.3-kDa protein

von Florian G. Deuschl
Dissertation
Datum der mündl. Prüfung:2008-12-11
Erschienen:2008-05-19
Betreuer:Prof. Dr. Torben Lübke
Gutachter:Prof. Dr. Torben Lübke
crossref-logoZum Verlinken/Zitieren: http://dx.doi.org/10.53846/goediss-3343

 

 

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Name:deuschl.pdf
Size:8.04Mb
Format:PDF
Description:Dissertation
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Zusammenfassung

Englisch

The mouse 66.3-kDa protein was identified as one of several putative novel lysosomal matrix proteins by analyzing mannose 6-phosphate receptors binding proteins (Kollmann K, Mutenda KE, Balleininger M, Eckermann E, von Figura K, Schmidt B, Lübke T (2005) Identification of novel lysosomal matrix proteins by proteome analysis. Proteomics 5(15), 3966–3678). The present work verifies the lysosomal localization of the endogenous 66.3-kDa protein by indirect immunofluorescence in mouse embryonic fibroblasts and by sub-cellular fractionation of tyloxapol-filled mouse liver lysosomes. The mouse 66.3-kDa protein expressed in HT1080 cells is synthesized as a precursor of 75kDa and subsequently processed by limited proteolysis to an N-terminal 28kDa and to a C-terminal 40kDa polypeptide which is further processed to a C-terminal 15kDa polypeptide. The 28kDa and 15kDa polypeptides accumulate in the lysosomal compartment. Northern blot analysis reveals high transcriptional levels in lung and testis, whereas Western blot analysis shows high protein levels in brain, lung, spleen and heart. Interestingly, in mouse the endogenous 66.3-kDa protein is processed in a highly tissue-dependent manner to mature forms. A possible function of the protein was investigated by affinity chromatography and interaction studies.
Keywords: 66.3-kDa protein; lysosomal protein; processing; transcription; protein expression

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Das murine 66.3-kDa-Protein wurde im Rahmen einer Proteomanalyse Mannose-6-Phosphat-bindender Proteine als eines von mehreren potentiell lysosomalen Matrixprotein identifiziert (Kollmann K, Mutenda KE, Balleininger M, Eckermann E, von Figura K, Schmidt B, Lübke T (2005) Identification of novel lysosomal matrix proteins by proteome analysis. Proteomics 5(15), 3966–3678). In der vorliegenden Arbeit gelang es, die lysosomale Lokalisation des endogenen 66.3-kDa-Proteins durch indirekte Immunfluoreszenz embryonaler Mausfibroblasten und durch subzelluläre Fraktionierung Tyloxapol-angereicherter Lysosomen aus Leberhomogenat nachzuweisen. Das 66.3-kDa-Protein wurde in HT1080-Zellen stabil exprimiert. Dort wird es durch limitierte Proteolyse aus einer Proform von 75kDa in ein N-terminales 28-kDa-Fragment und ein C terminales 40-kDa-Fragment und anschließend aus letzterem in ein C terminales 15-kDa-Fragment prozessiert. Das 28-kDa- und das 15-kDa-Fragment konnten intralysosomal nachgewiesen werden. Im Northern Blot konnte ein hoher Transkriptionslevel in Lunge und Hoden und im Westernblot eine hohe Proteinexpression in Gehirn, Lunge, Milz und Herz detektiert werden. Interessanterweise wird das endogene murine 66.3-kDa Protein höchst gewebespezifisch in aktive Fragmente prozessiert. Eine mögliche Funktion des Proteins wurde durch Affinitätschromatographie und durch Interaktionsstudien untersucht.
Schlagwörter: 66.3-kDa Protein; lysosomles Protein; Prozessierung; Transkription; Proteinexpression
 

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