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Identification of resistance sources and characterization of resistance factors in Brassica species to Verticillium longisporum

Identifizierung von Resistenzquellen und Charakterisierung von Resistenzfaktoren in Brassica-Arten gegenüber Verticillium longisporum

by Christina Eynck
Doctoral thesis
Date of Examination:2008-01-31
Date of issue:2008-03-18
Advisor:Prof. Dr. Andreas von Tiedemann
Referee:Prof. Dr. Andreas von Tiedemann
Referee:Prof. Dr. Heiko C. Becker
crossref-logoPersistent Address: http://dx.doi.org/10.53846/goediss-3415

 

 

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Name:eynck.pdf
Size:5.54Mb
Format:PDF
Description:Dissertation
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Abstract

English

The increasing area of oilseed rape cultivation particularly in the northern European countries has significantly promoted Verticillium longisporum, the causal agent of "Verticillium wilt" of Brassica crops, and thus has rendered this disease a major challenge for current resistance breeding efforts. One of the most promising means of controlling Verticillium within the scope of an integrated pest management in addition to the implementation of cultural practices is the use of resistant cultivars. Until now, for both winter and spring type oilseed rape, breeding for resistance has been severely hampered by the absence of sufficient resistance in commercially available breeding material. With these considerations, the chief objectives of this dissertation were to identify new sources of resistance and to characterize resistance factors in oilseed rape genotypes as well as in related Brassica forms with the long-term goal of improving the resistance of winter oilseed rape against V. longisporum. One major part of this work is concerned with the screening of different Brassica species, including B. napus, resynthesized oilseed rape forms and the progenitor species B. oleracea and B. rapa (syn. campestris) both in greenhouse and field studies. Due to the lack of correlation between greenhouse and field results, it is concluded that the eligibility of the screening assay as an isolated test method is equivocal. Thus, in order to identify genotypes that are undoubtedly resistant not only under standardized but also under field conditions, a combination of upstream greenhouse screenings and ensuing resistance tests in the field at several locations is indispensable. A further objective of this work was to identify mechanisms contributing to the overall resistance phenotype of Brassica varieties to V. longisporum and potentially useful for oilseed rape breeding programmes. In principle, two different approaches were pursued throughout this project: In the first instance, potential levels of resistance were identified by investigating the interaction of B. napus with a virulent, host-specific isolate of V. longisporum in comparison to the interaction with a host-heterologous strain of V. dahliae. In the first approach, the differential interactions of V. longisporum and V. dahliae on the root surface and in the root and shoot vascular system of B. napus were studied by confocal laser scanning microscopy (CLSM), using GFP tagging and conventional fluorescence dyes. This study provided novel information about the early stages of infection and colonization in the host and non-host-pathogen-interaction. Although V. dahliae was infrequently able to penetrate roots of B. napus, it failed to spread further into the shoot, as shown with real-time PCR. Furthermore, screening material with different levels of resistance to V. longisporum was used to differentially characterize relevant resistance factors. As a result, mechanisms were found which become operative after the pathogen has entered the plant, such as the build up of mechanical barriers like tyloses or vascular gels, as well as the reinforcement of constitutive barriers through the deposition of cell wall-bound phenols and lignin. Furthermore, the accumulation of soluble phenolics was observed. Although similar responses occurred in vascular tissues of both resistant and susceptible plants, they occurred with a higher intensity in the resistant B. napus and B. oleracea accessions. Thus, from these studies, differences in responses between the susceptible and the resistant interaction can be regarded as being quantitative rather than qualitative in nature. In both resistant Brassica genotypes the most active defence occurs in the hypocotyl tissue and seems to be based on similar if not the same mechanisms. This clearly corroborates the hypothesis that resistance traits in B. napus have been introgressed from B. oleracea.
Keywords: Brassica napus; Verticillium longisporum; quantitative resistance; confocal laser scanning microscopy; phenolics

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Die zunehmende Anbaufläche von Raps hat insbesondere in Ländern Nordeuropas zu einem verstärkten Auftreten von Verticillium longisporum, dem Erreger der so genannten Verticillium-Welke an Brassica-Arten, geführt. Ein viel versprechender Ansatz zur Bekämpfung dieses Pilzes im Rahmen eines integrierten Pflanzenschutzes ist der Anbau resistenter Sorten. Bislang wurde die Resistenzzüchtung sowohl im Winter- als auch Sommerraps allerdings erheblich durch das Fehlen einer ausreichenden Toleranz bzw. Resistenz im vorhandenen Zuchtmaterial erschwert. Vor diesem Hintergrund war es das Ziel dieser Arbeit, Resistenzquellen in verschiedenen Brassica-Arten zu identifizieren und mögliche Resistenzfaktoren zu charakterisieren, um die Resistenz von Winterraps gegenüber V. longisporum langfristig zu verbessern. Verschiedene Brassica-Arten, darunter B. oleracea- und B. rapa- (syn. campestris) Varietäten sowie Raps- und resynthetisierte Genotypen, wurden im Gewächshaus wie auch unter Feldbedingungen hinsichtlich ihrer Resistenzeigenschaften getestet. So sollten resistente oder zumindest teilresistente Genotypen identifiziert werden, die in künftigen Zuchtprogrammen Anwendung finden können. Obwohl zwischen den Ergebnissen aus den Gewächshaus- Untersuchungen und den Beobachtungsprüfungen im Freiland nur eine geringe Gesamtkorrelation bestand, erwies sich die Kombination beider Verfahren als geeignet, um robuste Resistenzquellen zu identifizieren. Um Mechanismen zu charakterisieren, die zu dem Resistenzphänotypen von Brassica-Arten gegenüber V. longisporum beitragen und für Rapszüchter potentiell nutzbar sind, wurden grundsätzlich zwei verschiedene Ansätze verfolgt. Zum einen sollte versucht werden, effiziente Resistenzfaktoren in Inokulationen mit virulenten Isolaten von V. longisporum gegenüber wirtsheterologen Stämmen von V. dahliae zu charakterisieren. So wurde die Interaktion von V. longisporum bzw. V. dahliae mit Raps im Bereich der Wurzeln und im vaskulären System des Sprosses mit Hilfe der Confocalen Laser Scanning Mikroskopie (CLSM) unter Verwendung sowohl GFP-markierter Stämme als auch konventioneller Fluoreszenzfarbstoffe analysiert. Diese Untersuchungen lieferten neue Informationen zur Frühphase in der Wirt- und Nichtwirt- Pathogen- Interaktion. Real- time PCR- Untersuchungen im Verlauf der Pathogenese zeigten, dass V. dahliae nicht in der Lage war, sich systemisch in den Spross auszubreiten, obwohl Infektionen der Wurzeln stattfanden. Des Weiteren wurde Screeningmaterial mit vorhandenen Resistenzunterschieden zur differentiellen Charakterisierung von Resistenzmechanismen herangezogen. Im Rahmen dieser Untersuchungen wurden Mechanismen identifiziert, die in Kraft treten, nachdem das Pathogen in die Pflanze eingedrungen ist. So wurde V. longisporum bei der Interaktion mit einem resistenten Wirt auf den unteren Bereich des Stängels begrenzt, eine akropetale Ausbreitung in den Spross war nicht möglich. Histologische Untersuchungen der wirtspezifischen Interaktion führten zu der Identifikation folgender unspezifischer Abwehrmechanismen: Bildung von Thyllen und/oder vaskulärer Gele, Akkumulation von Phenolen im Xylemparenchym und verstärkte Lignifizierung der Zellwände des Xylems und des Xylemparenchyms. Die Beteiligung von phenolischen Stoffen während der Abwehr konnte durch quantitative biochemische Analysen bestätigt werden. Bei der Ausprägung aller genannten Prozesse zeigte sich ein positiver Zusammenhang zwischen dem Resistenzniveau des betrac hteten Genotyps und der Stärke der Reaktion (Gefäßverschluss) bzw. dem Gehalt der betrachteten Komponenten. Bei der hier beschriebenen Resistenz von Brassica spp. handelt es sich somit um eine quantitative Ausbreitungsresistenz. Sowohl in dem resistenten Kohl- Genotypen als auch der resistenten Raps- Akzession traten Abwehrreaktionen am stärksten im Hypokotyl zutage und schienen auf den gleichen Mechanismen zu beruhen; dies stützt die Annahme, das Resistenzmerkmale von B. oleracea auf B. napus im Laufe interspezifischer Hybidisierungen zwischen B. rapa und B. oleracea übertragen worden sind.
Schlagwörter: Brassica napus; Verticillium longisporum; quantitative Resistenz; Konfokale Laser Scanning-Mikroskopie; Phenole
 

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