STED Microscopy of FRET Pairs

by Maria Loidolt-Krüger
Doctoral thesis
Date of Examination:2018-03-19
Date of issue:2018-05-18
Advisor:Prof. Dr. Stefan Hell
Referee:Prof. Dr. Stefan Hell
Referee:Prof. Dr. Sarah Köster
Persistent Address: http://dx.doi.org/10.53846/goediss-6860

 

 

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Format:PDF
Description:Dissertation

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Abstract

English

Förster resonance energy transfer (FRET) is a popular tool in life sciences, for example to detect protein-protein interactions and ligand binding, or to construct fluorescent biosensors for metabolites or ions. Obtaining such functional information provided by FRET from diffraction-unlimited images would be advantageous, because, for one thing, the spatial averaging of fluorescence signals could be reduced with a smaller detection volume, and, for another thing, FRET signals from neighboring subdiffraction areas could be distinguished. Thus, the goal of this thesis was to investigate the feasibility of measuring FRET using stimulated emission depletion (STED) microscopy. Numerical simulations of a single FRET pair under continuous-wave and pulsed STED illumination were performed to study the interplay of FRET and STED photophysics, including the influence of STED intensity and pulse delay. Organic fluorophores were screened to identify a STED-compatible FRET pair, and the dyes Atto532 and Star635P were chosen for further experiments. Fluorescence lifetime imaging (FLIM) STED microscopy of single FRET pairs bound to dsDNA at defined distances was performed with various STED laser powers and STED pulse delays. Thus measured fluorescence decay curves were compared with simulated ones to confirm the validity of the simplified photophysical model that was established to describe the measurement process. Based on this model, the measurement strategy was devised and the measurement settings were chosen. The spectral detection channels of donor, FRET and acceptor signals differ in spatial resolution; this excludes the use of intensity-based FRET quantification methods. Only the analysis of acceptor fluorescence decay curves can yield diffraction-unlimited FRET information. Large spectral shifts of the fluorescence emission of both fluorophores were observed in single-molecule measurements. STED imaging showed that emission shifts to shorter wavelengths can decrease the STED efficiency and thus the image resolution. The spectral shifts also change the spectral overlap integral of donor emission and acceptor absorption and thereby the FRET efficiency; the magnitude of this effect was estimated. In summary, a photophysical model for the interference of STED and FRET was established. Experimental requirements for STED imaging of FRET pairs were identified and a suitable data analysis strategy was proposed. Additionally, photoconversion of organic fluorophores was characterized and its effect on STED and FRET investigated.
Keywords: Microscopy; STED; FRET

German

Der Förster-Resonanzenergietransfer (FRET) ist ein beliebtes Werkzeug der Lebenswissenschaften. Er wird z.B. benutzt um Proteininteraktionen oder das Binden von Liganden zu detektieren, oder um fluoreszente Biosensoren für Stoffwechselprodukte oder Ionen zu konstruieren. Es wäre vorteilhaft, solche funktionellen Informationen, wie man sie durch FRET erhält, aus hochaufgelösten Bildern auslesen zu können. Zum einen würde die räumliche Mittelung der Fluoreszenzsignale durch ein kleineres Detektionsvolumen reduziert werden. Zum anderen könnten FRET-Signale aus dicht beieinander liegenden Zonen, die kleiner als die Beugungsgrenze sind, voneinander unterschieden werden. Daher war es das Ziel dieser Dissertation, die Durchführbarkeit von FRET-Messungen mittels STED-Mikroskopie (STED - Stimulated Emission Depletion) zu prüfen. Numerische Simulationen eines einzelnen FRET-Paares unter Dauerstrich- und gepulster STED-Beleuchtung wurden durchgeführt, um das Zusammenspiel der photophysikalischen Prozesse FRET und STED zu untersuchen, den Einfluss der STED-Laserintensität und der Pulsverzögerung mit eingeschlossen. Organische Fluorophore wurden getestet, um ein mit STED kompatibles FRET-Paar zu identifizieren; die Farbstoffe Atto532 und Star635P wurden für die weiteren Experimente ausgewählt. Fluoreszenzlebensdauer-STED-Mikroskopie einzelner FRET-Paare, die in bestimmten Abständen an doppelsträngiger DNA befestigt waren, wurde mit verschiedenen STED-Laserleistungen und STED-Pulsverzögerungen durchgeführt. Auf diese Weise gemessene Fluoreszenzlebensdauerhistogramme wurden mit simulierten Histogrammen verglichen, um die Gültigkeit des vereinfachten photophysikalischen Modells zu testen, welches entwickelt wurde, um den Messprozess zu beschreiben. Basierend auf diesem Modell wurde die Messstrategie entworfen und die Messeinstellungen gewählt. Die spektralen Detektionskanäle des Donor-, FRET- und Akzeptorsignals unterscheiden sich in der räumlichen Auflösung, dies schließt die Verwendung intensitätsbasierter FRET-Quantifizierungsmethoden aus. Nur die Analyse der Fluoreszenzlebensdauerhistogramme des Akzeptors kann beugungsunbegrenzte FRETInformationen liefern. Große spektrale Verschiebungen der Fluoreszenz beider Fluorophore wurden in Einzelmolekülmessungen beobachtet. In STED-Bildern zeigte sich, dass eine Verschiebung der Emission hin zu kürzeren Wellenlängen die STED-Effizienz verringern kann und damit auch die Auflösung der Bilder. Die spektralen Verschiebungen ändern auch das spektrale Überlappintegral von Donoremission und Akzeptorabsorption und dadurch die FRET-Effizienz; die Größe dieses Effekts wurde abgeschätzt. vi Kurz zusammengefasst wurde ein photophysikalisches Modell für die Interferenz von STED und FRET eingeführt. Experimentelle Voraussetzungen für die STED-Mikroskopie von FRET-Paaren wurden identifiziert und eine adäquate Datenanalysestrategie wurde vorgeschlagen. Zusätzlich wurde die Photoumwandlung organischer Fluorophore charakterisiert und deren Auswirkung auf STED und FRET untersucht.
 
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