Self-Organization and Mechanics of Minimal Actin Cortices attached to artificial Bilayers

by Markus Schön
Doctoral thesis
Date of Examination:2018-09-27
Date of issue:2018-10-23
Advisor:Prof. Dr. Claudia Steinem
Referee:Prof. Dr. Claudia Steinem
Referee:Prof. Dr. Sarah Köster
Persistent Address: http://dx.doi.org/10.53846/goediss-7111

 

 

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Abstract

English

One of the most versatile used protein structure in nature are actin filaments. They form contractile structures, like muscle fibrils, as well as complex network structures like the cellular cortex. The actin cortex is responsible for the shape, stability, mobility and further functions of the cell, which is realized by an interplay with over 100 accessory proteins. Concerning the shape and the mobility of cells, the connection between the actin cortex and the plasma membrane plays a pivotal role, which can be established by proteins of the ERM (ezrin-radixin-moesin) protein family. A vast number of proteins contribute to the variety of functions making it difficult to investigate the impact of the complex system’s single components. To reduce the complexity, an artificial minimal actin cortex (MAC) was created, consisting of a lipid bilayer, the physiological linker protein ezrin and an F-actin network. A dependency of the network density on the receptor lipid L-α-phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate (PtdIns[4,5]P2) concentration in the membrane was found using confocal laser scanning microscopy (CLSM). Denser F-actin networks were observed, using a higher surface coverage of ezrin, induced by a higher concentration of PtdIns[4,5]P2 lipids. The network’s height and the lateral fluidity of the lipid bilayer remained unaffected by an altered ezrin surface coverage. Interestingly, a filament sorting effect caused by network attachment was observed, which is apparent in decreasing filament lengths at higher densities of provided membrane connections. In general, smaller filaments were found in MACs in contrast to 3D F-actin gels. To analyze the mechanical properties of MACs video particle tracking microrheology was performed. The overall stiffness of the network showed a 15-fold increase in contrast to 3D F-actin network gels. An increasing density of anchoring points, induced by a higher PtdIns[4,5]P2 concentration, raised the stiffness further, proving that the rheological properties are governed by attachment of the network to the membrane. Indentation experiments on pore spanning membranes performed by means of atomic force microscopy showed that the lateral tension of the lipid bilayer can be altered by F-actin attachment. The influence on the membrane tension is strongly dependent on the resulting network morphology. The developed and characterized MAC was then used as a tool to investigate the impact of the accessory proteins fascin and α-actinin on the network morphology and the cortex dynamics by means of CLSM without interference from other proteins. Both proteins showed a rearrangement of the MAC: α-actinin recruited actin from the flat MAC and established bundled, spider-web like structures on top of the flat F-actin cortex. Fascin bundled the actin networks showing increased filament lengths and a decreased network density. These results demonstrate that MACs physiologically attached via ezrin are dynamic enough to investigate the biological functions of single accessory proteins.
Keywords: Actin; Ezrin; Minimal Actin Cortex; Bottom up approach

German

Eine der am vielseitigsten eingesetzten Proteinstrukturen in Zellen ist das Aktinfilament, welches beispielsweise lange Bündel, wie in Filopodia, oder Netzwerke, wie im Zellkortex, aufbauen kann. Der Zellkortex allein ist für viele Funktionen, wie die Stabilität, Form und Beweglichkeit der Zelle verantwortlich. Für die Erfüllung dieser Vielzahl an Funktionen wurden bereits über 100 Aktin assoziierte Proteine entdeckt. Dabei ist auch die Verknüpfung des Zytoskeletts zur Plasmamembran essenziell, welche über die Proteine der ERM (Ezrin-Radixin-Moesin) Familie erreicht werden kann. Die Vielzahl der in vivo beteiligten Proteine erschwert die Untersuchung der Einflüsse einzelner Proteine. In der vorliegenden Arbeit wurde ein Modellsystem aus artifizieller Membran, dem physiologischen Protein Ezrin und einem filamentösen Aktin (F-Aktin) Netzwerk entwickelt, um den Einfluss einzelner Proteine studieren zu können. Es konnte mit Hilfe von Fluoreszenzmikroskopie gezeigt werden, dass F-Aktin Netzwerke mit steigender Anzahl Membranverknüpfungen dichter werden. Die Anzahl der Verknüpfungen wurde durch Variation der Konzentration des Rezeptorlipides L-α-Phosphatidylinositol-4,5-Bisphosphat (PtdIns[4,5]P2) und der hiervon abhängigen Oberflächenbelegung des Protein Ezrin verändert. Die Höhe des Aktinkortex und die laterale Mobilität der Membran bleiben dabei unverändert. Im Vergleich zu einem polymerisierten Netzwerk in 3D wurden im minimalen Kortex deutlich kleinere Filamentlängen gefunden. Bei steigender Anzahl der Verknüpfungspunkte werden diese zunehmend geringer, welches auf eine bevorzugte Anbindung kleinerer Filamente im minimalen Kortex-Modell hindeutet. Mittels passiver Mikrorheologie konnte außerdem gezeigt werden, dass die membrangekoppelten Netzwerke eine 15-fach erhöhte Steifigkeit im Vergleich zu 3D Netzwerken aufweisen, welche mit steigender Verknüpfungszahl noch gesteigert werden kann. Zudem zeigten Indentationsexperimente mit Hilfe eines Rasterkraftmikroskops, dass die laterale Membranspannung durch das Anbringen eines Aktinnetzwerkes verändert werden kann. Diese Veränderung ist stark abhängig von der durch die Anbindung entstehenden Netzwerkmorphologie. Der entwickelte und bereits untersuchte Aufbau des minimalen Aktinkortex wurde weiterverwendet, um den Einfluss einzelner aktin-bindendender Proteine auf den Kortex ohne den störenden Einfluss weiterer Proteine zu untersuchen. Während durch die Interaktion mit Fascin Bündel mit längeren Filamenten geformt wurden, zeigte die Zugabe von α-Actinin, dass dieses Protein den Aktinkortex umstrukturiert und auf dem vorher flachen Kortex neue, Spinnennetz-artige Strukturen zusammenbindet. Diese Ergebnisse verdeutlichen, dass dieses biomimetische Modellsystem noch dynamisch genug ist, um biologische Funktionen einzelner Aktin-bindender Proteine schrittweise und individuell an diesen Minimalaufbauten zu untersuchen.
 
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