Functional Characterization of Hereditary Spastic Paraplegia Proteins Spastin and ZFYVE27
von Dasaradha Venkata Krishna Pantakani
Datum der mündl. Prüfung:2009-07-02
Erschienen:2010-04-20
Betreuer:Prof. Dr. Dr. Wolfgang Engel
Gutachter:Prof. Dr. Sigrid Hoyer-Fender
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Size:21.2Mb
Format:PDF
Description:Dissertation
Zusammenfassung
Englisch
Hereditary spastic paraplegias (HSP) are a heterogeneous group of genetic disorders characterized by progressive spasticity in the lower limbs caused primarily due to dysfunction of corticospinal tract neurons. All modes of inheritance such as autosomal dominant (AD), autosomal recessive (AR) and X-linked have been reported for HSP. Mutations in the SPG4/SPAST gene are the single most common cause for AD-HSP and accounts for up to 40% of all AD-HSP cases. In the present study, we have characterized the functional and structural properties of SPAST gene product, spastin and its interacting protein ZFYVE27, another HSP related protein.In the first part of this thesis, spastin oligomeric state as hexamer has been evaluated by biochemical and cellular approaches. Furthermore, structural information on hexameric spastin was obtained through modeling of spastin AAA domain and this modeled structure was used as a framework to classify the known mutations of spastin in HSP patients into four different functional groups based on the structural information.In the second part, compound heterozygous sequence variants of SPAST causing early age onset of HSP phenotype has been reported. The modifier effect of spastin known polymorphism (S44L) in association with another mutation has been described. Our findings further strengthen the threshold effect model of spastin, with a direct correlation between functional level of spastin and early age onset of HSP phenotype.In the third part, expansion of spastin mutational spectrum in a large HSP cohort has been reported with identification of 29 novel spastin mutations. Moreover, we attempted to determine any possible deleterious effects of these novel mutations on spastin oligomeric function using spastin structural model.In the last part of this thesis, we showed that ZFYVE27, a spastin interacting protein, functions as dimer/tetramer by means of cellular and biochemical analysis. Further, we show that although the core interaction region, hydrophobic region 3 (HR3) is dispensable for self-association of ZFYVE27, it is essential for neurite formation and co-expression of the truncated ZFYVE27 (∆HR3184-208) hampers the function of wild type ZFYVE27.Moreover, to dissect the role of ZFYVE27 in HSP pathomechanism, we endeavored to generate loss of function as well as gain of function mouse models for ZFYVE27. Conceivably, the phenotype of loss of function mouse model might mimic the clinical features of HSP. By elucidating the role of ZFYVE27 in neuritogenesis/neuropathies by means of generated mouse models, we will be able to gain novel mechanistic insights into the underlying pathomechanism of HSP.
Keywords: spastic paraplegia; Spastin; ZFYVE27; Neurodegeneration; Neuritogenesis; SPG4; AAA domain; FYVE; PtdIns; Hexamer
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Die Hereditären Spastischen Paraplegien (HSPs) sind
eine heterogene Gruppe von genetischen Erkrankungen,
die durch progressive spastische Lähmungen in den
unteren Gliedmaßen gekennzeichnet sind, was
hauptsächlich durch Funktionsstörungen der
Pyramidenbahn-Neuronen verursacht wird. Alle Arten der
Vererbung, wie autosomal dominant (AD), autosomal
rezessiv (AR) und X-chromosomal, sind für HSP bekannt.
Mutationen im SPG4/SPAST Gen sind der häufigste Grund
für AD-HSP und machen bis zu 40% aller AD-HSP Fälle
aus. In der vorliegenden Arbeit haben wir die
funktionellen und strukturellen Eigenschaften des SPAST
Genprodukts Spastin und dessen interagierenden Proteins
ZFYVE27, ein HSP zugehöriges Protein, untersucht.Im ersten Teil der Arbeit wurde der oligomere Status
von Spastin mit Hilfe von biochemischen und zellulären
Ansätzen als Hexamer identifiziert. Außerdem wurden
durch die Modellierung der Spastin AAA Domäne
strukturelle Informationen über das Spastin- Hexamer
erhalten. Diese modellierte Struktur diente wiederum
als Gerüst, um die bekannten Spastin Mutationen bei HSP
Patienten in vier funktionelle Gruppen einzuteilen.Im zweiten Teil der Arbeit wird über compound
heterozygote Sequenzvarianten von SPAST berichtet, die
ein frühes Auftreten des HSP Phänotyps verursachen. Ein
modifier effect des bekannten
Spastin-Polymorphismus (S44L) in Verbindung mit einer
anderen Mutation wird beschrieben. Unsere Ergebnisse
festigen ein Schwellenwert Modell von Spastin mit einer
direkten Korrelation zwischen funktionellem
Spastin-Level und frühem Auftreten des HSP
Phänotyps.Im dritten Teil konnte eine Erweiterung des
Spastin-Mutationsspektrums in einer großen HSP Kohorte
mit 29 neuen Spastin-Mutationen beschrieben werden.
Außerdem wurde versucht, alle möglichen negativen
Effekte dieser neuen Mutationen auf die oligomere
Funktion von Spastin mit Hilfe des Spastin
Strukturmodells zu ermitteln.Im letzten Teil dieser Arbeit konnte mit Hilfe von
zellulären und biochemischen Analysen gezeigt werden,
dass ZFYVE27, ein mit Spastin interagierendes Protein,
als Dimer/Tetramer wirkt. Weiterhin haben wir gezeigt,
dass die Hauptinteraktionsregion, die hydrophobe Region
3 (HR3), zwar nicht wichtig für die Selbstassoziation
von ZFYVE27 ist dafür aber essentiell für die
Neuritenbildung. Die Coexpression des verkürzten
ZFYVE27 (∆HR3184-208) erschwert die Funktion
des Wild-Typ ZFYVE27.Außerdem wurde damit begonnen, loss of function
und gain of function Mausmodelle für ZFYVE27
herzustellen. Damit kann die Rolle von ZFYVE27 im HSP
Pathomechanismus studiert wurden. Denkbarerweise könnte
das loss of function Mausmodell die phänotypischen
Merkmale von HSP nachahmen. Mit der Analyse der Rolle
von ZFYVE27 in der Neuritogenese/Neuropathie in den
Mausmodellen wird es möglich sein, neue Erkenntnisse
über den Pathomechanismus von HSP zu gewinnen.
Schlagwörter: Spastischen Paraplegie; Spastin; ZFYVE27; Neurodegeneration; Neurogenese; SPG4; AAA Domäne; FYVE; PtdIns; Hexamer