Methods to improve the sample quality of macromolecular complexes for structure determination by 3D Electron Cryo-Microscopy

Abstract

Makromolekulare Komplexe durchlaufen oft erhebliche strukturelle Veränderungen. Nicht nur unterscheiden sich die funktionellen Zustände voneinander, sondern ein einzelner funktioneller Zustand zeigt auch in sich konformationelle Heterogenität. Ein typisches Beispiel ist der Hefe spleißosomale B-Komplex vor und nach seiner katalytischen Aktivierung durch Prp2. Elektronenmikroskopie-Datensätze beider Zustände wurden verglichen und es konnte bestätigt werden, dass der Komplex bei der Aktivierung eine signifikante strukturelle Umgestaltung erfährt. Konformationelle Heterogenität begrenzt die Auflösung der 3D elektronenmikroskopischen Rekonstruktion oder erfodert die Lösung mehrerer unterschiedlicher Unterstrukturen - ein meist zeitaufwändiger Vorgang, der große Datensätze benötigt. In vielen Fällen wäre die Verringerung der konformationellen Freiheit von Vorteil: Mehr strukturelle Information könnte aus einem kleineren Datensatz gewonnen werden. Das GraFix Präparationsprotokoll verbessert die Probenqualität von Makromolekülen erheblich, indem es die Probe innerhalb eines Dichtegradienten chemisch mit dem Crosslinker Glutaraldehyd stabilisiert. Chemische und physikalische Modifikationen des Protokolls wurden untersucht. Mehrere Verbindungen wurden dem Gradienten zugesetzt und ihr Einfluss auf die Heterogenität wurde auf der 2D-Ebene ausgewertet. Allerdings führten die Modifikationen nicht zu einer eindeutigen Verbesserung der Probenqualität. Die Bemühungen wurden daher auf die Temperatur, bei der die Probe dem Crosslinker ausgesetzt wird, verlagert. Es wurde ausgewertet, ob eine Fixierung bei Temperaturen unterhalb von 0 °C die Probe in eine thermodynamisch bevorzugte Konformation bringen und die Bewegung innerhalb der Struktur sozusagen "einfrieren" könnte. Um die verringerte Glutaraldehyd-Aktivität bei niedrigerer Temperatur auszugleichen, wurden die Fixierungsbedingungen mit Hilfe von Glutamat-Dehydrogenase als Modellsystem optimiert. Als Grundlagenbeweis wurden 70S Ribosomproben kryofixiert. Die Verteilung der Rotationswinkel ihrer Untereinheiten wurde mit der von herkömmlich GraFix-behandelten, sowie mit der von unfixierten Proben verglichen. Die kryofixierten Proben zeigten eine merklich höhere Homogenität in ihrer Konformationsverteilung. Es konnte gezeigt werden, dass die Glutaraldehyd-Fixierung in der Lage ist, einen konformationellen Zustand bei niedrigerer Temperatur zu stabilisieren und diesen selbst bei anschließender Erwärmung auf eine höhere Präparationstemperatur beizubehalten. Damit wurde das "CryoFix-Protokoll" eingeführt, welches die Heterogenität weiter einschränkt. Dies ist ein weiterer Schritt auf dem Weg zu höherwertigen EM-Strukturen.