dc.contributor.advisor | Jahn, Reinhard Prof. Dr. | de |
dc.contributor.author | Boyken, Anne Janina | de |
dc.date.accessioned | 2013-01-30T11:31:43Z | de |
dc.date.available | 2013-01-30T23:51:29Z | de |
dc.date.issued | 2011-10-20 | de |
dc.identifier.uri | http://hdl.handle.net/11858/00-1735-0000-000D-F1DC-6 | de |
dc.identifier.uri | http://dx.doi.org/10.53846/goediss-3549 | |
dc.identifier.uri | http://dx.doi.org/10.53846/goediss-3549 | |
dc.description.abstract | Exozytose in präsynaptischen Nervenenden findet unter präziser zeitlicher und räumlicher Kontrolle statt. Synaptische Vesikel docken und fusionieren an speziellen Stellen an der Plasmamembran, sogenannten „aktiven Zonen“, die sich durch ein ausgeprägtes Protein-Netzwerk auszeichnen. Einige der beteiligten Proteine wurden bereits identifiziert und charakterisiert, allerdings ist die genaue molekulare Zusammensetzung dieser docking sites noch nicht geklärt. Proteomische Analysen dieser Fraktionen sind aufgrund der schwierigen biochemischen Isolierbarkeit, insbesondere der Abtrennung der aktiven Zone von der postsynaptischen Membran und der postsynaptischen Dichte, limitiert. In dieser Arbeit wird eine neue Methode eingeführt, die eine nahezu quantitative Trennung von prä- und postsynaptischen Membranfraktionen erlaubt. Die hier gezeigte Methode basiert auf einer milden Proteolyse von Synaptosomen, wodurch die extrazellulären Domänen der trans-synaptischen Adhäsionsmoleküle abgebaut werden und so die Verbindung zwischen den Membrankompartimenten aufgehoben wird. Im Anschluss an den proteolytischen Verdau werden die Synaptsomen durch osmotischen Schock lysiert und die einzelnen Komponenten (präsynaptische Plasmamembran mit gedockten Vesikeln, postsynaptische Dichte, freie Vesikel) durch Zentrifugation in einem Dichtegradienten separiert. Mit Antikörpern gerichtet gegen das Vesikelprotein Synaptophysin wurden beide Vesikelpopulationen (gedockte und freie Vesikel) separat voneinander aus dem Dichtegradient immunoisoliert. Die beiden Vesikelfraktionen wurden unter Verwendung quantitativer Massenspektrometrie miteinander verglichen. Neben allen wichtigen Vesikelproteinen, die in beiden Fraktionen im gleichen Verhältnis vorhanden waren, konnten in der gedockten Vesikelfraktion zusätzlich fast alle bekannten Proteine der aktiven Zone identifiziert und angereichert werden. Darüber hinaus enthielt die gedockte Vesikel Fraktion viele Ionenkanäle und Transporter der Plasmamembran, Adhäsionsmoleküle sowie weitere Proteine, die an der synaptischen Transmission beteiligt sind. Bemerkenswerterweise wurden nur sehr wenige postsynaptische Proteine oder Proteine anderer Organellen (mit Ausnahme von Mitochondrien) detektiert, was die Spezifität der Methode bestärkt. Besondere Aufmerksamkeit gelten den mehr als 30 neuen, bisher uncharakterisierten Proteinen, die in der gedockten Vesikelfraktion identifiziert werden konnten und von denen eines (JB1) näher untersucht wurde. Unter Verwendung eines neu generierten Antikörpers konnte eine präsynaptische Lokalisation von JB1 bestätigt werden. Zusätzlich zur Identifizierung von Proteinen kann die hier angewandte Methode auch verwendet werden um Veränderungen im präsynaptischen Proteom durch Effektoren zu quantifizieren. Inkubation der gedockten Vesikelfraktion mit dem Rab Effektor GDI führte zu einer signifikanten Reduktion der Rab-Proteine, die übrigen identifizierten Proteine in der gedockten Vesikelfraktion wiesen keine quantitiven Veränderungen auf. | de |
dc.format.mimetype | application/pdf | de |
dc.language.iso | eng | de |
dc.rights.uri | http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/ | de |
dc.title | Molecular profiling of presynaptic docking sites | de |
dc.type | doctoralThesis | de |
dc.title.translated | Molekulare Zusammensetzung präsynaptischer Dockingstellen | de |
dc.contributor.referee | Jahn, Reinhard Prof. Dr. | de |
dc.date.examination | 2011-07-04 | de |
dc.subject.dnb | 570 Biowissenschaften, Biologie | de |
dc.subject.gok | WHC 000 | de |
dc.description.abstracteng | In presynaptic nerve endings, exocytosis
of synaptic vesicles is restricted to specialized areas of the
plasma membrane, called active zones, that are distinguished by
electron-dense material. Here synaptic vesicles attach to the
release sites (docking) and are then activated (priming) before
undergoing calcium-dependent exocytosis, releasing their
neurotransmitter content into the synaptic cleft. Many of the key
players of the presynaptic exocytotic machinery are known, and also
the major scaffold proteins of the active zone have been
identified. However, the precise molecular composition of the sites
at which vesicles dock remains to be elucidated. Proteomic
approaches to identify protein components of these sites are
challenging because of difficulties in purifying these sites. Most
importantly it has been very difficult to separate presynaptic
membranes from postsynaptic membranes and the postsynaptic protein
scaffold. Here we report about a new procedure allowing for an
almost quantitative separation of pre- and postsynaptic membrane
fractions. The procedure involves mild proteolysis resulting in the
cleavage of the adhesion molecules connecting pre- and postsynaptic
membranes, followed by gradient centrifugation, lysis of the
presynaptic compartment, separation of free and docked vesicles,
and immunoisolation using antibodies specific for synaptic vesicle
proteins as the final purification step. Using quantitative
proteomics we then compared the protein composition of free and
docked vesicles. In the latter fraction we detected all major
active zone proteins. In addition we identified many ion channels
and transporters, cell adhesion molecules and plasma
membrane-specific signaling proteins that have been reported to be
involved in synaptic transmission. Only very few postsynaptic
proteins or proteins derived from other organelles (except of
mitochondria) were detected. The docked vesicle fraction contained
more than 30 previously uncharacterized proteins, many of which are
predicted to contain single or multiple transmembrane domains.
Preliminary characterization of one of the new membrane proteins
using a newly generated antibody revealed specific localization to
presynaptic nerve terminals, raising the possibility that the
protein is involved in presynaptic function. Additionally, this new
procedure was used to quantify changes in the presynaptic proteome
as a result of effector treatment. The Rab effector GDI efficiently
removed Rab proteins from the docked vesicle fraction, but no other
significant changes were observed among the remaining 500
identified proteins in the docked vesicle fraction. | de |
dc.contributor.coReferee | Ficner, Ralf Prof. Dr. | de |
dc.subject.topic | Göttingen Graduate School for Neurosciences and Molecular Biosciences (GGNB) | de |
dc.subject.ger | Synapse | de |
dc.subject.ger | Axon | de |
dc.subject.ger | aktive Zone | de |
dc.subject.ger | Docking | de |
dc.subject.ger | Synaptische Vesikel | de |
dc.subject.eng | synaptic transmission | de |
dc.subject.eng | synapse | de |
dc.subject.eng | active zone | de |
dc.subject.eng | docking | de |
dc.subject.eng | synaptic vesicles | de |
dc.subject.bk | 42.15 Zellbiologie | de |
dc.subject.bk | 42.63 Tierphysiologie | de |
dc.identifier.urn | urn:nbn:de:gbv:7-webdoc-3191-4 | de |
dc.identifier.purl | webdoc-3191 | de |
dc.affiliation.institute | Göttinger Graduiertenschule für Neurowissenschaften und molekulare Biowissenschaften (GGNB) | de |
dc.identifier.ppn | 730360865 | de |