Assembly pathway of the fungal COP9 signalosome

by Fruzsina Erzsébet Bakti
Doctoral thesis
Date of Examination:2022-02-28
Date of issue:2022-12-20
Advisor:Prof. Dr. Gerhard Braus
Referee:Prof. Dr. Kai Heimel
Referee:Prof. Dr. Ralf Ficner
Persistent Address: http://dx.doi.org/10.53846/goediss-9637

 

 

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Abstract

English

The conserved eight-subunit COP9 signalosome (CSN complex) controls the exchange of E3 ubiquitin cullin RING ligase receptors, and therefore the specificity of protein degradation in eukaryotic cells and it is required for multicellular development. The CSN complex of the filamentous fungus Aspergillus nidulans assembles through a seven-subunit pre-CSN complex, which is activated by the final integration of the catalytic CsnE deneddylase, thereby forming an eight-subunit CSN, as in humans. The goal of this work was to identify the assembly pathway of fungal pre-CSN complex in vivo by combined genetic and biochemical approaches. Loss of CsnE and the abolishment of the pre-CSN complex formation result in distinct fungal phenotypes. All fungal COP9 signalosome subunits are required for sexual development and secondary metabolism. Subunits of the pre-CSN complex additionally support wild type-like growth and asexual development. Functional GFP-CSN subunit fusions can complement the corresponding phenotypes. GFP-CSN subunit-based GFP-affinity enrichments combined with mass spectrometry allowed the identification of interacting CSN subcomplexes. The interactome analysis revealed, as one major result, that two distinct heterotrimeric CSN subcomplexes are intermediates of the assembly pathway. These heterotrimers, CsnA-CsnC-CsnH and CsnD-CsnF-CsnG, are formed independently of CsnB. CsnE cannot associate to either any of the heterotrimers or CSN subunits without CsnB, which supports that this subunit acts as link between the two trimeric subcomplexes. Subtle cellular feedback surveillance mechanisms control that equal CSN subunit amounts are available for CSN assembly. Accordingly, loss of csn subunit genes differentially changes protein levels of remaining CSN subunits. Subunits of both heterotrimeric subcomplexes are required to reach wild type-like CsnA protein amounts, which is part of the CsnA-CsnC-CsnH subcomplex. In contrast, relative protein levels of CsnD, which is part of the CsnD-CsnF-CsnG trimer, are increased, if the pre-CSN complex cannot be formed. CsnG is a prerequisite to connect subunits of the CsnD-CsnF-CsnG subcomplex and it is part of the surveillance for the cellular CsnD amounts. Furthermore, CsnA and, therefore the CsnA-CsnC-CsnH trimer, is required for appropriate CsnB amounts, because the inability to form CsnA-CsnC-CsnH reduces relative levels of the CsnB bridging protein. These results support a complex orchestration for providing sufficient levels of subunits for the correct CSN assembly pathway, which includes a mutual control of the formation of both trimers. In addition, the cellular abundance of the CsnE deneddylase and the CsnB linker are adjusted independently of each other. An additional level of control includes the cellular localization of CSN subunits. The stable octameric CSN complex is enriched in nuclei, whereas CSN subassemblies inhabit different cellular compartments. The CsnD-CsnF-CsnG trimer is predominantly nuclear localized, whereas CsnA-CsnC-CsnH is evenly distributed between nuclei and cytoplasm. Nuclear enrichment of the linker CsnB is independent of the deneddylase subunit, but depends on CsnA and, therefore, an intact CsnA-CsnC-CsnH trimer. This suggests that CsnB is transported into the nuclei together with CsnA. In summary, the fungal COP9 signalosome is assembled through two trimeric subcomplexes linked by CsnB, which enables final association with the CsnE deneddylase. Formation of the functional CSN complex requires a sophisticated interplay between mutual control of subunit protein levels, correct localization and sequential assembly.
Keywords: COP9 signalosome, CSN complex, pre-CSN complex, native CSN subcomplexes, assembly, affinity purification, subcellular localization, Aspergillus nidulans

German

Das COP9 Signalosom (CSN Komplex) ist ein Proteinkomplex aus acht Untereinheiten, der in höheren Eukaryoten konserviert ist und für die multizelluläre Entwicklung benötigt wird. CSN kontrolliert den Austausch von Substrat-Rezeptoren von E3 Ubiquitin-Cullin-RING Ligasen und damit die Spezifität des Protein-Abbaus in eukaryotischen Zellen. Beim Aufbau des CSN Holokomplexes des filamentösen Pilzes Aspergillus nidulans wird im letzten Schritt die katalytische CsnE Deneddylase-Untereinheit in einen sieben-Untereinheiten Prä-CSN Komplex eingebaut. Hauptziel der Doktorarbeit war die in vivo Identifikation der zellulären Schritte, die für den Zusammenbau des Gesamtkomplexes aus den einzelnen CSN- Untereinheiten notwendig sind. Dafür wurden genetischen und biochemischen Methoden kombiniert. Alle CSN Untereinheiten werden für die sexuelle Entwicklung und den dazu gehörenden Sekundärmetabolismus benötigt. Daneben können einzelne Untereinheiten des Prä-CSN Komplexes das Wachstum der Kolonie und die asexuelle Entwicklung unterstützen. Entsprechende funktionelle GFP-CSN Fusionsproteine, die alle diese Phänotypen komplementieren können, wurden für GFP-Affinitätsanreicherungen und anschließende Massen-Spektrometrie in unterschiedlichen csn-Mutanten verwendet. Ein Hauptergebnis dieser Interaktom-Analyse war die Entdeckung von zwei heterotrimer Subkomplexen als Zwischenstufe für den Aufbau des CSN Komplexes. Diese beiden Trimere, CsnA-CsnC-CsnH und CsnD-CsnF-CsnG, werden unabhängig von CsnB gebildet. CsnE ist nicht in der Lage mit einem der beiden Trimere zu interagieren, wenn CsnB in der Zelle fehlt. CsnB ist daher notwendig, um die beiden Trimere zum Prä-CSN Komplex zu verbinden und damit die Inkorporation von CsnE als finalem Schritt der Komplexbildung zu ermöglichen. Die zellulären Proteinmengen für die einzelnen CSN Untereinheiten werden durch unterschiedliche Feedback-Mechanismen kontrolliert. Die Wild-Typ-Menge an CsnA Protein wird nur dann in der Zelle erreicht, wenn ausreichend Proteine für die anderen Untereinheiten der beiden Trimere vorhanden sind. CsnA wird andererseits benötigt, um ausreichende Mengen des Brücken-Proteins CsnB zu bekommen. Die Menge an CsnD, das ein Teil des CsnD-CsnF- CsnG Trimers darstellt, wird umgekehrt erhöht, wenn ausreichende Mengen anderer Untereinheiten des Prä-CSN Komplexes fehlen. Diese Ergebnisse weisen auf ein komplexes zelluläres Überwachungssystem, das die Proteinmengen für die beiden Trimere, für das Brückenprotein CsnB und die Deneddylase CsnE, und damit den akkuraten Aufbau des gesamten CSN Komplexes kontrolliert. Ein weiteres Kontrollsystem steuert die zelluläre Lokalisierung der CSN Untereinheiten. Der stabile acht-Untereinheiten CSN Holokomplex ist überwiegend im Zellkern lokalisiert. Der CsnD-CsnF-CsnG Subkomplex befindet sich auch vorwiegend im Nukleus, während das CsnA-CsnC-CsnH Trimer zwischen Zytoplasma und Zellkern verteilt ist. Die Anreicherung des Brückenproteins CsnB im Zellkern erfordert CsnA, aber nicht die CsnE Deneddylase. Vermutlich wird CsnB daher mit CsnA oder mit dem CsnA- CsnC-CsnH Trimer in den Kern transportiert. Insgesamt ergab die hier durchgeführte Analyse, dass der zelluläre Aufbau des COP9 Signalosoms bei A. nidulans über die Bildung zweier Trimere führt, die durch CsnB verknüpft werden. Dies ermöglicht dann die Inkorporation der CsnE Deneddylase als einziger Untereinheit des CSN Holokomplexes mit intrinsischer Enzymaktivität. Der Aufbauprozess erfordert ein vielfältiges Zusammenspiel zwischen wechselseitiger Kontrolle der Proteinmengen der Untereinheiten, deren korrekter zellulärer Lokalisierung und ihres sequentiellen Zusammenbaus.
 
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