From the centrosome to the nuclear envelope and beyond: insights into the role of CRM1 in adenoviral genome delivery
von Floriane Lagadec
Datum der mündl. Prüfung:2020-06-02
Erschienen:2020-07-09
Betreuer:Prof. Dr. Ralph H. Kehlenbach
Gutachter:Prof. Dr. Dörthe Katschinski
Gutachter:Prof. Dr. Beate Sodeik
Gutachter:Prof. Dr. Stefan Pöhlmann
Dateien
Name:PhD thesis Floriane Lagadec 2020 Uni Göttingen.pdf
Size:7.61Mb
Format:PDF
Zusammenfassung
Englisch
Adenoviruses (AdV) are DNA viruses that replicate in the nucleus of their host cell. Due to the limited coding capacity, they have to take advantage of cellular mechanisms in order to perform their infection cycle. During entry, AdV particles use the microtubule transport machinery to reach the nucleus. AdVs interact with the microtubule motor dynein to be transported towards the nuclear compartment, where they dock to Nuclear Pore Complexes (NPCs), structures embedded into the nuclear envelop (NE). Once at the NPC, viral capsids disassemble to finally release and import their genome. Microtubule unloading, nuclear translocation and genome import of AdVs involve components of the nucleocytoplasmic transport machinery. However, the exact mechanism used by the virus to reach the NPC remains unclear. Nucleocytoplasmic transport involves different components and is tightly regulated. The active transport of cargoes is mediated by import and export factors interacting with RanGTP. The major cellular export factor CRM1 is known to be essential for targeting of AdVs to the NE. Pharmacological inhibition of CRM1 with Leptomycin B leads to the accumulation of AdVs at the centrosome, the major Microtubule Organisation Centre (MTOC) in mammalian cells. We thus investigated the role of CRM1 leading to AdV genome delivery. We analysed the interaction of AdV with the MTOC and observed that the absence of cytoplasmic factors and disruption of microtubules did not impair their accumulation at the MTOC. We identified and characterized a mutant of CRM1, functional for physiological export but inducing a strong delay in AdV NE translocation. We used live cell-imaging to analyse infections in mitotic cells, revealing a role of CRM1 in genome release from the capsid. Moreover, we identified a potential viral partner of CRM1 among the AdV genome associated core proteins, the Terminal Protein. Terminal protein contains a nuclear export signal and is a CRM1 export substrate. Taken together, our data highlight a possible role of CRM1 as an essential mediator for the complete dismantling of AdV capsid, promoting genome release and genome import.
Keywords: Adenovirus; CRM1; Centrosome; Nucleocytoplasmic transport
Deutsch
CRM1 im Transport adenoviraler Genome Adenoviren (AdVs) sind DNA-Viren, die sich im Zellkern ihrer Wirtszelle replizieren. Wegen ihrer limitierten Verpackungskapazität müssen sie zelluläre Mechanismen ausnutzen, um ihren Infektionszyklus durchzuführen. AdV Partikel nutzen das Mikrotubuli-Transportsystem, um den Zellkern zu erreichen. Sie interagieren mit dem Motorprotein Dynein, um entlang der Mikrotubuli in Richtung des Zellkerns transportiert zu werden. Dort docken sie an Kernporen (NPCs) an, Strukturen die innerhalb der Kernhülle (NE) eingebettet sind. An den NPCs angekommen, lösen sich die virale Kapside auf, um schließlich ihr Genom freizusetzen und zu importieren. Für das Entladen von Mikrotubuli, die nukleare Translokation und den Genom-Import von AdVs wird die nukleozytoplasmatische Transportmaschinerie genutzt. Der exakte Mechanismus, der von den Viren verwendet wird, um die NPCs zu erreichen, ist jedoch unklar. Der nukleozytoplasmatische Transport beinhaltet verschiedene Komponenten und ist innerhalb der Zelle genau reguliert. Der aktive Transport von Proteinen wird durch Import- und Exportfaktoren vermittelt, die mit RanGTP interagieren. Der wichtige zelluläre Exportfaktor CRM1 hat eine essentielle Rolle beim Transport von AdVs zur Kernhülle. Pharmakologische Inhibition von CRM1 mittels Leptomycin B führt zu der Ansammlung von AdVs am Zentromer, dem primären Mikrotubuli-organisierenden Zentrum (MTOC) in Säugetierzellen. Wir haben deshalb die Rolle von CRM1 innerhalb von AdV Genomabgabe untersucht. Bei der Analyse der Interaktion von AdVs mit dem MTOC konnten wir feststellen, dass die Abwesenheit von zytoplasmatischen Faktoren und die Dissoziation von Mikrotubuli ihre Akkumulation am MTOC nicht beeinträchtigten. Wir identifizierten und charakterisierten eine Mutante von CRM1, die funktionell bezüglich Proteinexport aus dem Zellkern ist, aber eine Verzögerung von AdV NE-Translokation bewirkte. Wir nutzten Live-Cell-Imaging, um Infektionen in mitotischen Zellen zu analysieren, und deckten dabei eine Rolle von CRM1 bei der Genomfreisetzung aus dem Kapsid auf. Weiterhin identifizierten wir einen potentiellen viralen Partner von CRM1, das Terminal Protein, welches mit dem AdV Genom assoziiert ist. Das Terminal Protein enthält ein nukleares Exportsignal und ist ein CRM1-Exportsubstrat. Zusammenfassend zeigen unsere Daten eine mögliche Rolle von CRM1 als essentiellem Vermittler bei der vollständigen Auflösung des AdV Kapsids, wodurch die Genomfreisetzung und der Genomimport gefördert werden.Weitere Sprachen
Les adénovirus (AdV) sont des virus à ADN se répliquant dans le noyau de la cellule hôte. Pour pouvoir se répliquer, ils détournent la machinerie cellulaire à leur profit. Au cours de l’entrée dans la cellule, les particules virales utilisent la machinerie de transport des microtubules pour rejoindre le noyau. Les AdV interagissent avec la dynéine, moteur moléculaire associé aux microtubules, pour être transportés vers le compartiment nucléaire. Ils se lient alors aux pores nucléaires, structures ancrées dans l’enveloppe nucléaire (EN). Une fois aux pores nucléaires, les capsides virales se désassemblent pour libérer et importer leur génome. Les mécanismes de détachement des microtubules, de translocation nucléaire et d’import du génome des AdV impliquent des facteurs de la machinerie de transport nucléocytoplasmique. Cependant, le mécanisme exact utilisé par les virus pour atteindre les pores nucléaires n’est pas clairement défini. Le transport nucléocytoplasmique est composé de différents facteurs et est hautement régulé dans les cellules. Le transport actif de cargos est dû à des facteurs d’import et d’export interagissant avec RanGTP. Le principal facteur d’export est CRM1 et il est connu pour être essentiel dans la translocation des AdV vers l’EN. L’inhibition de CRM1 par la Leptomycine B conduit à l’accumulation des AdV au centrosome, le principal Centre Organisateur des Microtubules (COMT) des cellules de mammifères. Nous avons donc étudié le rôle de CRM1 dans la libération du génome adénoviral. Nous avons analysé l’interaction des AdVs avec le COMT et nous avons observé que l’absence de facteurs cytoplasmiques ainsi que la perte d’intégrité des microtubules n’affectaient pas leur accumulation au COMT. En revanche, nous avons identifié et caractérisé un mutant de CRM1, qui reste fonctionnel pour l’export physiologique de cargo mais qui induit un retard important dans la translocation des AdV vers l’EN. Nous avons utilisé l’imagerie sur cellules vivantes pour analyser l’infection de l’AdV dans des cellules mitotiques et ceci a permis de révéler le rôle de CRM1 dans la libération du génome de ce virus. Nous avons également identifié un partenaire viral potentiel pour CRM1 parmi les protéines associées au génome viral, la Terminal Protein (TP). Cette protéine possède un signal d’export nucléaire et est un substrat de CRM1. Nos données soulignent le rôle de CRM1 comme un médiateur essentiel au désassemblage total de la capside adénovirale, qui favorise la libération du génome et son import.